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   口服玫瑰纯露之大鼠急性毒性评估






    摘 要

    玫瑰纯露又称为玫瑰花水,系以水蒸气蒸馏法萃取玫瑰花瓣所得之产品,可作为香精、化妆品原料或饮料等多样用途。为了解以健康安全的栽培方式,所生产出符合我国「食用花卉规范」的玫瑰花瓣原料所研制之玫瑰纯露其食用之安全性,直接以水蒸气蒸馏法萃取玫瑰花瓣所得之4:1 (W/V)纯露样品,对大鼠进行口服急性毒性试验,测试剂量为5 g/kg ,投予后連续观察14 天。结果显示,试验期间全部鼠只均无中毒症狀或死亡;在体重及增重方面,「玫瑰纯露」处理组及对照组间并无显著差異。血液学及血清生化学检测结果,并未显示有与试验物质有关之影响。大鼠体内重要脏器,亦均无明显因试验物质引起之肉眼及组织病理变化。综合试验结果显示,「玫瑰纯露」对大鼠之口服急性毒性LD50 值为大于5 g/kg,适量口服玫瑰纯露,应无急性毒性副作用并具安全性。本项试验研究,为我国台湾地区首度以香药草作物进行蒸馏萃取所得之纯露产品为目标进行之急性毒性评估试验,结果具有參考价值,并可供未來相关产品进行安全性评估之參考依据。

    关键字:玫瑰纯露、口服急性毒性、50% 致死剂量(LD50)。

    前 言

    纯露的英文名称为「hydrosols」,意指「水溶液」,以往它是植物精油萃取过程的副产品,著名的仅有「玫瑰水」与「柑桔水」兩项产品,如今由于其相较于植物精油,属于安全性较高,且兼具植物精油之功用,目前国际市场已有上百项的香药草植物被开发出纯露产品上市,成为新兴的天然美容保养品,国际与国内市场均呈现逐渐热络之趋势(14)。玫瑰纯露即消费市场习称「玫瑰水」的产品,具温和的保湿与收敛性功用,可作为开发调理肌肤的美容保养产品之原料,亦可直接利用为化妆水或泡澡,达到放松及恢復活力之功能。玫瑰纯露也适宜将之开发饮料、甜点、冰類或酒類制品,作为增添香气之使用。国内约有300 公顷的玫瑰切花生产面积,其中面积最大的属埔里镇已达50余公顷,为协助当地农会辅导农民扩大国产玫瑰之栽培面积与多样化利用,乃积极地除原來玫瑰的切花生产导向外,开创以美容、保养、食用等高附加价值之用途。本计画研究目的为测试行政院农业委员会台中区农业改良场研制之「玫瑰纯露」对哺乳动物之安全性,借以建立产品安全资料(Material Safety Data Sheet) ,提供使用时安全评估之參考。试验于国立中兴大学动物疾病诊断中心进行,试验依据卫生署健康食品安全性评估- 口服急毒性试验规范(1),并符合美国环保署(USEPA) ( Health Effects TestGuidelines, OPPTS 870.1100, Acute oral toxicity , US EPA 712–C–98–190. In: OPPTSHarmonized Test Guidelines, Series 870.3050, EPA712–C–00–366, 1998) 及经济合作暨开发组织( OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Section 4: Health Effects. No. 420: Acute OralToxicity-Fixed Dose Procedure, No. 423: Acute Oral Toxicity-Acute Toxic Class Method, No. 425:Acute Oral Toxicity-Up and Down Method, 2001)等试验规范进行口服急性毒性试验。

    材料与方法

    样品制备

    「玫瑰纯露」样品为行政院农业委员会台中区农业改良场试验田所栽培之玫瑰( Rosa spp.)品种,该品种系自市售佳娜红(Grand Gala) 选育出的品系。采用符合卫生署颁订之「食用花卉规范」,所生产的新鲜花瓣( 图一) 为原料,经清洗后,以水蒸气蒸馏设备进行蒸馏萃取,入料量为2 公斤之玫瑰花瓣,取其5:1 (W/V;鲜花重:萃取液体积) 比例的萃取液( 即玫瑰纯露)为试验材料。样品外观呈透明无色液体,比重约为1。保存于4 ℃冰箱中,试验纯度视为100%。水蒸气蒸馏法是应用高热的水蒸气将植物体中的挥发性成分或称香气分子之化学键结打断后随同水蒸气带出來,再利用冷凝管将水蒸气与香气分子冷凝为液态,随后再经过油水分離程序即可获得植物精油,而萃取过程中所搜集水溶性的部份即称为纯露。本试验所使用材料仅有2 公斤,故仅能搜集到纯露。

    供试动物

    5 周龄大鼠(SD 品系),购自樂斯科生技园区实验动物培育及研发中心( 宜蘭,台湾),动物房温度设定为20~22 ℃及12小时光/12 小时暗之光照周期。以鼠专用粒狀饲料(LabDiet500135Rodent diet, Purina Mills LLC, St. Louis, MO, USA) 及逆渗透水供应,经1 周适应期后进行试验。动物试验之进行经中兴大学动物实验委员会审核通过(IACUC: 97-052) ,实验动物之使用与操作,均依据中华实验动物学会之『实验动物管理与使用指南』规范进行(15)。

    试验步骤

    口服急性毒性试验分为5 g/kg 剂量组及喂食蒸馏水之对照组,每组10只大鼠( 雌、雄各半) ,以饱和苦味酸染剂于背部作编号标識。口服急性毒性试验之试验样品纯度视为100%,试验时以逆渗透水稀释玫瑰纯露;配置试验浓度为0.5 g/ml。以不锈钢胃管,依体重经口喂食投予体积量为10 ml/kg 。处理后每日观察并每周称体重1 次,至处理后第14天止。试验结束时,大鼠以气体麻醉(2% Isoflurane, Halocarbon Laboratories, South Carolina, USA) 后经腹主动脉采血,并达完全放血后牺牲,进行大体解剖,检查体内脏器之肉眼及组织病理变化。

    血液学检查

    试验结束后,大鼠以Isoflurane麻醉,自腹主动脉采集全血放入含EDTA 抗凝血剂之试管(K3 EDTA syringes, Vacutainer, NJ, USA),于血球计數仪(Sysmex K-4500, Toa MedicalElectronics Co., Ltd., Kobe, Japan)检测血液相(complete blood count, CBC) 。包括红血球數(redblood cell count, RBC count) 、血红素(hemoglobin, Hb) 、血球容积比(hematocrit, Hct) 、平均红血球体积(mean corpuscular volume, MCV) 、平均血红素(mean corpuscular hemoglobin, MCH) 、平均血红素浓度(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC) 及血小板(platelet) 等项目。白血球分類(differential leukocyte count) 以血液抹片,经Weigert"s Iron Hematoxylin StainKit (AJP Scientific Inc., NJ. USA)染色后,于光学显微镜400 倍下,计算白血球中,淋巴球、嗜中性球、单核球、嗜酸性球及嗜碱性球等百分率(%) 等。

    血清生化检查

    试验结束后,大鼠以Isoflurane麻醉,自腹主动脉采集全血放入含EDTA 抗凝血剂之试管,復以離心机(Kubota 2010, Tokyo, Japan) ,于3,000 rpm離心15分钟,取上清液血清(serum),以血清生化仪(Chiron Diagnostics Corporation, Oberlin, OH, USA) 检测肝及肾血清酵素值,包括天门冬胺酸转胺酶(aspartate aminotransferase, AST)、丙胺酸转胺酶(alanine aminotransferase,ALT)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN) 、肌酸酐(creatinine) 等项目。

    脏器病理检查

    以2% Isoflurane 麻醉后经腹主动脉放血后牺牲及解剖,秤脑、心、肝、肾、脾、胸腺、肾上腺,睪丸及卵巢等脏器重量(g ),并以最后一周之最终体重(g),作为体内脏器重量比率(%)之计算。观察肉眼病理变化,取脏器浸泡于10% 中性福马林溶液固定1 周,经组织粗修与石臘包埋后,以石臘组织切片机(Leica RM 2145, Nussloch, Germany) 制成2 μ m 厚度之组织切片,经Hematoxylin & Eosin (H&E) 染色,于光学显微镜观察组织病理变化。并依据Shackelford等人之方法进行组织病理变化描述及病理评估,标准为5 等级:1 = 极微(minimal, < 1%); 2 = 轻微(slight, 1~25%); 3 = 中度(moderate, 26~50%); 4 = 中度严重(moderate/severe, 51~75%); 5 =极度严重(severe/high, 76~100%)。36

    结果分析

    试验期间各组之体重变化,依体重(g)或增重(g 或%)变化,以统计分析软体Microsoft Excel进行Pair Students t -test 进行组间比较分析,其组间显著差異水准为p<0.05 。试验结束后,若处理组动物死亡數超过处理动物數半數(50%) ,以统计方式求取药剂量与死亡率之回归方程式,计算动物半數致死剂量(LD50值) 及其95% 可信赖区间(confidence limit) 。

    结果与讨论

    结果显示,以「玫瑰纯露」口服投予大鼠后,全部鼠只无中毒症狀或死亡( 表一) ,显示测试样品对大鼠之口服急性毒性LD50值大于5 g/kg 。 「玫瑰纯露」处理组雄、雌鼠第0、7 及14天时体重及增重亦无明显影响( p >0.05) (表二) 。

    血液学检查(complete blood count, CBC) 方面,雌鼠白血球总數(WBC count) 、红血球总數(RBC count)、血红素(Hb) 、血球容积比(Hct)、平均红血球体积(MCV)、平均血红素(MCH) 、平均血红素浓度(MCHC) 、血小板总數(PLT) 及白血球分類等均无明显差異( 表三及四) 。而雄鼠仅在红血球总數(RBC count) 、血球容积比(Hct)及血小板总數(PLT) 项目于对照组(6.8±0.3106/ μ l 、41.4±2.4 % 及895.8±1 66.3 103/ μ l) 与处理组间(7.2±0.2 106/ μ l 、45.9±0.8 % 及1132±117.8103/ μ l) 虽具显著性差異( p <0.05) ,但已知雄鼠红血球总數(RBC count) 正常生理值范围为6.76~7.45 106/ μ l,血球容积比(Hct) 正常生理值范围为36~48 % ,血小板总數(PLT) 正常生理值范围为500~1300 103/ μ l(5)。上述數值皆于正常生理值范围内,同时并无出血或贫血等相关毒性症狀出现,显示并无臨床病理学上之意义,均无与试验物质有关之影响。

    在肝及肾血清酵素值( 表五) 方面,尿素氮(BUN) 及肌酸酐(creatinine) 项目在对照组雄鼠(17.1±1.9 mg/dl 及0.5±0.0 mg/dl)及处理组雄鼠(12.3±2.3 mg/dl 及0.4±0.1 mg/dl)间具显著性差異( p <0.05) ;而天门冬胺酸转胺酶(AST) 在对照组雌鼠(144.8±12.8 U/l) 及处理组雌鼠(89.6±19.4U/l) 间具显著性差異( p <0.05) 。其余肝肾血清酵素指标,如丙胺酸转胺酶(alanineaminotransferase, ALT) 组间则无差異( p >0.05) 。已知雄鼠尿素氮(BUN) 及肌酸酐(creatinine) 正常生理值范围分别为16±3 mg/dl 及0.4±0.1 mg/dl ,而雌鼠天门冬胺酸转胺酶(AST) 正常生理值范围为104±16 U/l(Harkness and Wagner, 1989)。因此上述數值皆于正常生理值,显示并无臨床病理学上之意义,均无与试验物质有关之影响。

    体内脏器重量包括脑、心、肝、肾脏、脾脏、胸腺、肾上腺、睪丸及卵巢重量及百分比与对照组比较均无明显差異( 表六)。检查体内脏器,结果显示对照组与处理组之脑、心、肝、肾脏、脾脏、胸腺、肾上腺、睪丸及卵巢等重要脏器均无因试验物质引起之肉眼病理变化( 图二及三;表七) 。

    组织病理检查在对照组与处理组均出现肝脏局部、轻微至轻度单核细胞浸润(mononuclear cell infiltration)病变,对照组雄雌鼠发生率为0/5及1/5,处理组雄雌鼠发生率则为1/5及2/5。此外,仅对照组雌鼠肝脏细胞出现极微脂肪滴浸润,发生率为2/5,对照组雄鼠及处理组雌雄鼠则无( 图四及五、表八) 。以上病变在对照组与处理组间并无剂量相关性,为自发性病变,与试验物质无关。

    综合以上试验结果,玫瑰纯露对大鼠之口服急性毒性半致死剂量(LD50) 每公斤体重大于5公克,符合依据世界卫生组织(WHO)对毒性之等级分類(7),是属于「正常使用时无毒性(unlikelyto present hazard in normal use) 」物质。据此,针对本试验所制备之玫瑰纯露,经换算人体口服食用后所产生的急性毒性危害的评估应是安全无虞的。


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