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   原生绞股藍之总绞股藍皂苷含量分析暨其试制产品之毒理试验研究






    

    摘 要

    本研究主要目的,在于调查台湾原生绞股藍植株,其总绞股藍皂苷之含量,以期能筛选得一生长快速,且含高量绞股藍皂苷之绞股藍植株,以做为未來进一步进行组织培养,大量生产瓶苗,及开发含绞股藍成份保健产品之基础。本研究同时也确立了1套以分光光度计法施作,可符合美国药典(USP) 确效标准之总绞股藍皂苷含量分析方法;期能透过该品管方法之建立,俾能在未來,有利于绞股藍此一素材在保健产业之应用。同时,鉴于绞股藍相关之保健食品在坊间较少以胶囊剂型存在,本研究亦针对一个由本场自行开发,含绞股藍萃取物之胶囊产品,进行急毒性及Ames试验,结果均呈现阴性反应。

    关键词:绞股藍、绞股藍皂苷、毒性。

    前 言

    绞股藍为葫蘆科( Cucurbitaceae) 植物绞股藍( Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makino.)之根狀茎或全草。分布于中国大陸南部地区及陕西、甘肃等省,日本九州及北海道,以及韩国、东南亚一带,台湾亦有生产。绞股藍的保健功效自古即有记载(1,18),其能清热解毒,生津止嗽,润肺,袪痰化瘀,消炎镇痛,滋补强壮。而晚近的科学研究亦发现,绞股藍在抗氧化(3,30,40)、抗癌(5,6,9,12,14,20,22,27,33,34,46)、抗衰老(4)、抗疲勞(8)、保肝(7,13,15,16,17,21,23,31,32)、降血脂(2,35,36,41)、增强免疫力(11,26,27,39,42,44)、过敏体质调节(28)、心血管疾病预防(24)、保护胃黏膜(38),与降血糖(19,25,37,43,45)等方面,均有相当不错的成效。

    虽已经长期且大量使用,但至今对于台湾地区采集之绞股藍材料中,主要功效成份,总绞股藍皂苷(gypenosides) 之含量,却尚未有相关之调查研究报告。为筛选一生长快速,且含高量总绞股藍皂苷之绞股藍植株,以做为未來大量生产瓶苗之基础,本研究针对不同之台湾原生绞股藍品系,进行总绞股藍皂苷含量之分析。此外,为使有「南方人參」美誉之称的绞股藍,在保健产业上能有更广泛的应用,本研究亦尝试确立一套供绞股藍原料品管之方法,并针对本场所开发之一个含绞股藍原料之保健产品,进行相关之毒性试验。

    材料与方法

    种原收集与样品处理

    绞股藍种原系由国立自然科学博物馆严新富博士提供。搜集之种原以泥炭土为介质,盆栽方式栽培繁殖于本场温室。选取生长良好植株( 栽植年龄1.5个月,于二月份采收) 之地上部,以热风烘箱55℃干燥后,作为测定绞股藍总皂苷含量之材料。

    总绞股蓝皂苷含量分析方法

    本试验以人參皂苷Rg 1为比对标准品。取10 mg/ml之标准品溶液500 μ l ,以甲醇稀释至2ml,得浓度约为2,500 μ g/ml ,此为标准品储备溶液。再分别取不同体积之分析标准品溶液至10 ml 有盖试管中,吹干溶剂,再加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2 ml ,过氯酸0.8 ml ,加盖摇晃均匀,以60℃水浴加热15分钟,冷却至室温后加入5 ml冰醋酸,依序制备成最终浓度分别为50、100 、150 、200 、250 及300 μ g/ml 之检量线分析溶液。

    精确秤取1.5 g之绞股藍干品,装入濾筒,放置于索氏萃取器中,加入40 ml 氯仿,加热回流至萃取液呈无色。移除氯仿萃取液,并使残留之氯仿挥发至干后,将样品残渣連同濾筒放入有盖之锥形瓶中,加入50 ml正丁醇后秤重,以超音波震荡30分钟,冷却至室温后再次秤重,并以正丁醇补足散失的重量。量取20 ml正丁醇萃取液蒸发至干,以甲醇溶洗残渣并移至10 ml定量瓶中,以甲醇定量至10 ml,此为分析样品储备溶液。然后取样品储备溶液120 μ l 至10 ml 有盖试管中,吹干溶剂,再加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2 ml ,过氯酸0.8 ml ,加盖摇晃均匀,以60℃水浴加热15分钟,冷却至室温后加入5 ml 冰醋酸,作为样品分析溶液。于550 nm波长下,分析样品中之总绞股藍皂苷含量。

    总绞股蓝皂苷含量分析确效指标及执行方法

    配制六种不同浓度的Rg 1 标准品溶液,由低至高各检测三次,以浓度为x 轴,吸光度为y轴,做线性回归,得最佳线性程式y = ax+b 及其相关系數r2。相关系數r2应大于0.995以上。接着配制3 种不同浓度之标准品溶液,各重复分析2 次,以线性回归算出结果,求得浓度,并计算回收率。

    另进行精密度试验。 1. 注入重复性:配制一已知浓度之标准品,重复注入七次。所得吸光度之CV% 应小于2%;2. 分析重复性:配制三种不同浓度,但在检量线线性范围内之标准品溶液,各重复分析2 次,所得吸光度之CV% 应小于2%;3. 中间性精密度:执行试验时,以不同批号之试剂,各进行2 次分析,以比较兩组不同人员之分析差異。最后进行稳定性试验,取已知浓度之标准品,分别于指定的时间内,进行处理后分析,以比较储备溶液之稳定性。此六个时间点所得吸光度之CV%应小于5%。

    急毒性大鼠口服投予试验( 极限)

    本试验目的,是在观察由本场自行开发含绞股藍萃取物之胶囊产品,经口服投予单一剂量(5,000 mg/kg)至大鼠后所可能引发之急毒性变化。本试验以Sprague-Dawley (SD)大鼠( 雌雄各6 只) 为供试动物,饲料与饮水均为自由摄取。25试验开始前,动物需禁食8 小时以上,试验开始当日口服投予一次。试验物质以注射用蒸馏水,配制成500 mg/ml 后进行投予;对照组则投予注射用蒸馏水。试验期间每日进行臨床观察,并记錄动物是否有其他臨床症狀或死亡。试验结束时,所有存活的动物,经麻醉后牺牲进行剖检,以肉眼检查外观、口腔、颅腔及胸、腹腔内所有组织器官并做成纪錄。

    沙门氏菌回复突变试验

    本试验依据OECD guideline 471 进行,试验使用之沙门氏菌株学名分别为TA97a 、TA98、TA100 、TA102 及TA1535,此五菌株皆为组氨酸之营养缺陷株,菌株购自Discovery PartnersInternational, SanDiego, CA, USA ;菌株鉴定方式以菌株对于组氨酸之需求性,抗生素ampicillin、tetracyclin 的敏感性,以及紫外光、结晶紫对于菌株的生长抑制性來做判定。本试验之肝脏活化酵素使用Moltox公司之S-9,酵素混合液,配方如下:每毫升S-9混合液含β -NADP (4 mM) 、glucose-6-phosphate (5 mM)、MgCl2(8 mM)、KCl (33 mM)、sodium phosphatebuffer (100 mM)、S9 fraction (40 μ l/ml)。

    本试验之测试组别为7 组,分为不加S-9混合液,及加S-9混合液兩大類,共为14组。各剂量组及正、负对照组皆三重覆试验。待确认供试菌株后,以无菌水调整供试物质浓度,使最终剂量为5 、2.5、1.25 、0.625、0.3125 ml/plate ,将供试物质添加于培养基上预放之无菌纸锭( 直径0.6 cm 之濾纸) ,经培养24至48小时后,观察纸锭周围是否有产生抑菌环( 细胞毒性) 或大量菌落形成之环带( 致变性) ,并计算每个剂量组以及正、负对照组之回復突变菌落,并取其三重覆培养皿之菌落平均數及标准差。

    结果与讨论

    分析确效测试结果

    本试验结果可得最佳线性程式y =0.0035x-0.0219,及其相关系數r2=0.9988,此符合先前对于「线性及其范围」条件之设定r2>0.995。在准确度方面,三次试验之回收率分别为102.7%、99.1% 、98.5% ,可得平均回收率为100.1%,合于回收率须介于90%~110% 之要求。精密度测试部分,注入重复性之CV%值为0.04% ;分析重复性则不論在低、中、或高浓度下,其CV%值均小于2.0%,合于规范,中间精密度为1.87% ,亦符合相关规范的要求。稳定性试验可求得CV%值为4.07% ,亦可达到小于5.0%的要求。由试验结果可知,本次使用于总绞股藍皂苷含量测定所使用之方法,能符合美国药典(USP) 之确效标准。台湾原生绞股蓝之总绞股蓝皂苷含量分析结果以经过确效的总绞股藍皂苷含量测定方法,针对不同品系之台湾原生绞股藍,进行总绞股藍皂苷含量之分析,分别得如下表结果( 图一)。由试验结果得知,以于GT2 品系能测得最高的总绞股藍皂苷含量值,可考虑日后做为进一步进行组织培养,大量生产瓶苗所使用之植株。

    急毒性大鼠口服投予试验结果

    试验结果显示,试验期间各剂量组与对照组皆无发现任何臨床症狀。而在死亡率方面,试验期间各剂量组与对照组皆无发现大鼠死亡的情形;同时,在体重与饲料摄取量方面,各剂量组之大鼠体重与对照组相较,亦无显著差異。而各剂量组与对照组于试验结束后,均无发现任何肉眼可观察之病变。因此,根据本试验结果,此一由本场自行开发,含绞股藍萃取物之胶囊产品,在剂量5,000 mg/kg 时,对大鼠并未产生相关之毒性反应。

    沙门氏菌回复突变试验结果

    试验结果显示,本试验所使用的5 个菌株S. typhimurium TA97a、TA98、TA100 、TA102及TA1535,其基因型皆符合本试验所需( 表一) 。

    本次试验所有组别之负对照组其自发性突变菌落平均數,均落在有效范围内;而正对照组所引起的回復突变菌落數也均符合试验要求,所以本次试验之數据皆为有效數据。同时,本试验中各浓度之供试物质于添加S-9或未添加S-9活化处理后,观察TA97a 、TA98、TA100 、TA102 及TA1535五株试验菌株所产生的回復突变菌落數结果显示:TA97a 、TA98、TA100 及TA102 之回復突变菌落數未达负对照组之2 倍以上,而TA1535亦未达3 倍以上( 表二) 。这意谓剂量浓度为5 、2.5、1.25 、0.625、0.3125 ml/plate 之供试物质( 含绞股藍萃取物之胶囊产品) ,无論有无经过大鼠肝脏酵素活化过程,五株试验菌株TA97a 、TA98、TA100 、TA102 及TA1535之回復突变菌落數与负对照组相比较,皆未达阳性反应判定标准。所以在本试验条件下,本场自行开发之含绞股藍萃取物胶囊产品,于沙门氏菌回復突变试验之结果判定为阴性反应。

    本研究以绞股藍为试验材料,已初步开发出一个含绞股藍原料且安全可供食用之胶囊型保健食品,与一个可供前述产品品管并经确效完成之总绞股藍皂苷含量分析方法。


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