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   栽培奥勒冈属植物纯露及精油之抑菌效果初探






    
    摘 要

    本研究主要目的,在于针对本场栽种5种不同品种之奥勒冈属植物(TDM-1、TDM-2、TDO-1 、TDO-2 、TDO-3)材料之萃取液,进行抑菌效果之分析,以期评估奥勒冈属植物萃取液对于不同植物病原菌之抑菌效果,并做为未来进一步开发植物抗病资材或保健产品原料之依据。试验结果发现,以水蒸气蒸馏法萃取奥勒冈属植物材料所得之纯露,对于水稻病原菌包括纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、小粒菌核病菌(Nakataea irregular )、秧苗立枯病菌(Sclertoium rolfsii )、胡麻叶枯病菌(Helminthosporium oryzae)、徒长病菌(Fusariumfujikuroi )及甜柿叶枯病菌(Pestalotia spp.) 等均无抑菌效果。但以水蒸气蒸馏法萃取奥勒冈属植物材料所得之精油,则对于花卉软腐病菌(Pectobacterium chrysanthemi isolate CAS 7)、十字花科软腐病菌(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)、水稻细菌性谷枯病菌(Burkholderia glumae )及蝴蝶兰细菌性软腐病菌(Pectobacterium chrysanthemi isolate PC1)等细菌性病害之病原菌具有良好之抑制效果。若比较不同品种奥勒冈属植物精油之抑菌效果,则可发现以TDM-1、TDM-2、TDO-2 、TDO-3 等之精油具有较佳之抑菌效果;其中TDO-2 之精油则于稀释至5%时,其抑菌效果仍较Gentamicin 10 μg 纸锭更佳。

    关键词:奥勒冈属、抑菌、精油。

    前 言

    在高温多湿的环境下,病害往往造成作物重大损失,农民为了减少损失而大量喷施农药则又危害到消费者食品卫生安全,也对环境造成极大的冲击,因此非农药防治包括利用微生物制剂与植物源农药,已成为许多国家研究人员努力开发的方向。在病虫害防治方面,本场研究人员曾利用木醋液防治玫瑰二点叶螨(1),获得满意的成效,亦有相当多研究人员开发植物性防治药剂,探讨其作为植物保护制剂防治病害的效果(4),例如胡等(5)曾探讨八十种植物以水或是乙醇萃取物的抑菌效果,筛选出大风子等数种具有抗菌潜力的抗菌液,证实植物萃取物在生物防治上有其应用潜力,并且对环境友善。    

    奥勒冈属植物为一个由约20几种辛香植物所组成的芳香药草家族,原产于于西亚、欧洲至北非与地中海区域,目前在全球都有广泛种植,在中国大陆亦有栽培(13,19)。本属植物包含知名的香草作物奥勒冈Origanum vulgare (L.) ,英文名Oregano ,以及马约兰Origanummarjorana (L.),英文名Sweet Marjoram。奥勒冈之叶及全草具有香味,在义大利南部、土耳其、巴勒斯坦、希腊、葡萄牙及南美洲等均被广泛使用作为香料(10)。马约兰又名马郁兰、甜马约兰、甜牛至等,原产于北非、南欧及中亚等地,经人为栽培后,今分布范围包括欧洲、地中海区域以及北美与南美地区,在料理、食品工业( 食品保存剂)(2,3,17,18,21,28)、保健品、化妆品(6,7)等产业上皆有利用。在西方的传统医学上,马约兰甚至被使用于协助舒缓气喘(22)、帮助消化、促进血液循环(12)、减缓头痛及风湿症状等(9,10,11,30)。奥勒冈之萃取精油富含萜类及多酚类,主成份有百里香酚(thymol) 及香芹酚(carvacrol) ,其他成分还包括α-terpinen ( 松油烯) 、ρ-cymene ( 对异丙基甲苯) 、terpinene-4-ol ( 帖烯4醇)(14,23,24)等,其中酚类被认为是抗氧化的主要成分(26)。马约兰精油则分成两种主要型态,第一种为以帖烯四醇(terpinen-4-ol) 及水合桧烯(sabinene hydrate)为主;第二种则以百里香酚(thymol) 及香芹酚(carvacrol) 为主(10,11,12)。近年来,与奥勒冈属植物精油有关的应用性研究渐受重视,诸多研究报告显示奥勒冈及马约兰精油具有广泛之抗菌与抑菌效果,动物试验结果显示其具有促进免疫系统之功效、减少幼龄动物腹泻、改善饲料转化率及促进动物生长(8,13)。举凡食品与蔬果防腐保鲜剂(16,26)、抗氧化剂(20,21)、可于保养及化妆品中添加之天然抑菌剂、饲料添加物(18,19)、人用保健食品等皆属于其应用范围,在医学应用上也发现可抑制乳癌肿瘤细胞生长(15)、诱导肠癌细胞凋亡(27)。马约兰精油则常被使用为可添加于食品中的香料,亦可作为香水原料。

    鉴于奥勒冈属植物精油已有许多抑菌功效报导,且本场栽培试验结果显示其颇适合于在台湾地区栽植,因此针对台湾常见之病害菌株,进行本土栽培奥勒冈属植物之精油与纯露抑菌试验,以评估本土栽培奥勒冈属植物未来应用之潜力。

    材料与方法

    实验材料

    一、精油制备

    选取本场栽种5 种奥勒冈属植物,包括奥勒冈、日本马约兰、义大利马约兰等五种植物( 编号TDM-1、TDM-2、TDO-1 、TDO-2、TDO-3)之新鲜地上部,以水蒸气蒸馏法进行精油萃取。将不同品种之奥勒冈属植物秤取鲜重2 kg,分别以4,000 mL之蒸馏水加热进行蒸气蒸馏萃取约2 hr ,蒸气经由导管引入冷凝管后,以分馏瓶盛装收集,定量1,000 mL的蒸气冷凝液( 纯露)中约可获得0.1~1 mL之精油。抗菌试验中如精油需稀释成不同浓度时,均以丙酮为溶剂进行稀释。   

    二、微生物培养基

    真菌与细菌培养使用购自BD Bioscience 之马铃薯葡萄糖洋菜培养基(DifcoTM PotatoDextrose Agar,简称PDA)或营养洋菜培养基(DifcoTM Nutrient Agar,简称NA) ,PDA配方每公升含Potato starch 4 g、Dextrose 20 g 、Agar 15 g;NA配方中含有Beef extract 3 g、Peptone 5 g 、Agar 15 g。 LB液体培养基配方每公升含Tryptone 10 g 、NaCl 10 g、Yeast extract 5 g、NaOH 2ml。

    三、抗生素纸锭

    抗生素纸锭使用含Gentamicin 10 μ g 及30 μ g 之抗菌测试纸锭(Antimicrobial SusceptibilityDiscs, OXOID Co.),对照组为丙酮。使用时先摆放于培养基上适当位置,精油试验则以丙酮稀释精油至所需比例,添加10 μ L 至空白纸锭之上。

    研究方法

    一、奥勒冈属植物纯露针对植物真菌病害之抑菌试验:

    1. 供试菌株:水稻病原菌包括纹枯病菌( Rhizoctonia solani) 、小粒菌核病菌( Nakataeairregular )、秧苗立枯病菌( Sclertoium rolfsii)、胡麻叶枯病菌( Helminthosporium oryzae) 、徒长病菌( Fusarium fujikuroi) 及甜柿叶枯病菌( Pestalotia spp.) ,前述菌株均由本场作物环境课预测研究室提供。

    2. 抑菌活性测定:以5 种不同的奥勒冈属植物供试纯露,分别配制含有10% 及20% (v/v)纯露之供试(PDA) 培养基及对照用培养基(PDA) 。复以钻孔器钻取供试真菌的菌丝块后,将切下菌丝块放置于供试用培养基上,各供试液三重覆试验。根据各供试真菌生长速度之不同,将培养皿放置于28℃培养数天,待对照组平板已长满供试真菌后,测量供试平板上未长出供试菌丝之百分比,以评估供试纯露之抑菌效果。如供试平板长满供试菌株,则判定供试纯露无抑菌效果。

    二、奥勒冈属植物精油针对植物细菌病害之抑菌试验:

    1. 供试菌株:花卉软腐病菌( Pectobacterium chrysanthemi isolate CAS7中兴大学植物病理系细菌研究室提供) 、十字花科软腐病菌( Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum ) 、水稻细菌性谷枯病菌( Burkholderia glumae) 及蝴蝶兰细菌性软腐病菌( Pectobacterium chrysanthemi isolate PC1) ,前述菌株均由本场作物环境课预测研究室提供。

    2. 抑菌活性扩散试验:将供试病原细菌于LB培养液中,37℃培养一天;以分光光度计于波长600 nm下测定菌液浓度,供试菌量需达到108cfu/mL,此时吸光值约为0.3。使用玻璃喷雾瓶将菌液均匀喷布于NA( 十字花科软腐病菌、花卉软腐病菌、由种子分离之水稻细菌性谷枯病菌) 或PDA(由叶面分离蝴蝶兰细菌性软腐病菌) 培养基上,再以丙酮为溶剂,制备体积百分比浓度为10% 与5%的供试精油样品。以滤纸圆盘吸附各供试精油样品10 μ L ,置于已喷布菌液的NA或PDA培养基上,空白对照组的滤纸片则吸附10 μ L 的74丙酮,并放置含固定量之抗生素纸锭(Gentamicin 10 μ g) 作为正对照组。将培养皿于37°C培养24 hr后,测量记录培养皿上抑菌圈的大小。

    结果与讨论

    植物性材料应用于植物保护制剂的萃取方法主要为水萃、甲醇或乙醇萃取(4),精油则是以蒸气萃取方式进行,不同材料与萃取方式对于病菌抑制可能会有不同的效果(25)。胡等(5)曾以水萃以及乙醇萃取马约兰,测试萃取物对土壤镰孢菌、土壤炭疽病菌、百合灰霉菌等五个菌株,发现皆无抑制孢子发芽的效果。然而胡等并未测试奥勒冈精油与纯露对作物病原菌生长或孢子发芽的影响。

    由于文献中曾报导奥勒冈属植物的精油具有广泛的抑菌效果(16,19,24),故推测在萃取过程,应也有部分可能具抑菌效果的挥发性成分溶于纯露中,由于精油在植物中含量较低,如果要大面积喷施植物性防治药剂,纯露在成本上当较具有竞争优势,因此本研究除了取奥勒冈精油之外,同时也测试纯露对病原菌生长抑制的效果。但本试验不论加入之供试纯露为何,供试平板均长满供试菌株,故判定供试之奥勒冈属植物纯露对于水稻纹枯病、水稻徒长病、水稻胡麻叶枯病、水稻小粒菌核病、水稻秧苗立枯病、甜柿叶枯病等病害之病原菌均无抑制菌丝生长效果( 资料未呈现) 。

    在精油抑菌试验结果显示,五种奥勒冈属植物之精油,对于此次供试之4 株植物病原菌,均有抑菌效果。表一为各不同奥勒冈属植物精油对于花卉软腐病原菌之抑菌性,TDO-1品种之精油仅于未稀释前可产生抑菌效果,在五个品种间之抑菌能力较差。 TDO-2品种之精油,则于稀释至10% 浓度时,对于花卉软腐病原菌之生长,较之Gentamicin 10 μ g 标准纸锭之抑制效果仍佳,未来将进一步评估以其开发能抑制花卉软腐病原菌抗菌材料之机会。

    针对于十字花科软腐病原菌之抑菌性,试验发现,纯精油以TDM-1抑菌效果最佳,TDO-1品种之精油仅于未稀释前可产生抑菌效果,在五个品种间之抑菌能力最差。当精油稀释到10%及5%时,仅有TDO-2品种之精油呈现较高的抑菌力,且优于Gentamicin 10 μ g 标准纸锭,极具有开发相关抑菌产品之潜力。 TDO-3 品种之精油之抑菌效果虽于原液时与TDM-1、TDM-2相当,但稀释至10% 时,已无抑菌效果。未来在选择精油材料时,应优先考虑TDO-2 品种。

    表三为各不同奥勒冈属植物精油对于水稻细菌性谷枯病( 种子) 原菌之抑菌性,试验发现,以TDM-1精油为例,虽然原液之抑菌效果颇佳,其抑菌圈甚至大于Gentamicin 30 μ g 抗生素标准纸锭所能产生者( 图一) 。但是,无论是TDM-1或其他各不同品种之奥勒冈属植物精油在经过稀释后,抑菌效果均较供为正对照组之Gentamicin 10 μ g 抗生素标准纸锭为差;因此,如拟以供试品种之奥勒冈属植物精油做为开发相关水稻细菌性谷枯病抗菌资料之原料,就商品开发的角度而言,可行性较低。 

    综合以上抗菌试验结果,5 种不同品种的奥勒冈属植物精油对于测试之真菌皆无抑制菌丝生长之作用;而其中TDO-2 、TDM-1、TDM-2品种之精油对于测试之细菌,除了B. glumae抑菌能力相较对照组差之外,对于P. chrysanthemi isolate CAS7 、P. carotovorum subsp.carotovorum 与P. chrysanthemi isolate PC1之抑菌能力均接近或优于对照组,其中以TDO-2 品种之精油效果最为明显,其中CAS7与PC1 菌株均为花卉软腐病菌,而CAS7由文心兰上所分离;PC1 则是由蝴蝶兰所分离,虽然不同来源,但TDO-2 品种之精油仍然有优异的抑菌能力,显示具有良好的潜在防治能力,未来需进一步测试抗菌相关试验,以取得最佳防治浓度与基础资料。

    本次试验结果显示,不同品种之奥勒冈属植物精油多具有良好的抑菌效果,特别是TDO-2品种之精油,于稀释至较低浓度时,仍具有与抗生素相当之抑菌效果,惟仍应进一步试验,以求得各不同奥勒冈属植物精油对于供试菌种之最小抑制浓度(MIC, minimuminhibitory concentration) ,作为未来进一步评估该等精油于农业有机抗病资材之参考依据。而奥勒冈属植物纯露之抑菌能力偏弱,未来应用于农业抗菌资材产品开发之机会较小。本试验结果与Souza氏的研究团队(16,28,29)之研究结果相符,虽然使用不同的菌株,但奥勒冈属植物精油对于一般作物致病菌具有广泛之抗菌效果。因精油的取得成本稍高,透过适宜配方之设计,仍可开发为有机农业使用之抗菌资材,未来亦可进一步以食品污染菌或人、畜致病菌做为试验对象,以评估台湾地区栽种之奥勒冈属植物精油于食品及蔬果保存剂、保健食品、化妆品等产业上应用之可能性。利用植物资源开发植物保护制剂是执行生物防治的主要方法之一,许多植物具有特殊的含硫配糖体、生物碱、酚类、鞣质、皂素、帖类等化合物,可用于制作植物性农药,例如日本虎杖( Reynoutria japonica ) 萃取液可防治甜瓜白粉病、扛板归萃取液可防治水稻稻热病,乳化的葵花油、丁香油可防治作物白粉病、炭疽病等(4,5),农业试验单位可栽培多种植物资源,未来可以多方尝试不同作物萃取物的抗病与抗虫效果,进一步开发具生物防治功效的农业资材,达成发展永续农业的目标。


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