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   水稻抗白叶枯病之分子标志辅助育种





    摘 要

    白叶枯病是国内水稻重要的细菌性传染病,由Xanthomonas oryzae pv. oryzae 感染所引起,为控制此传染病之危害,目前研究已发现30 个以上的抗病基因,国际水稻研究所并育成以IR24 品系为遗传背景且带有各种抗病基因的近同源系,IRBB66为其中之一。本试验分别以台中籼10 号与台粳9号为母本,抗白叶枯病品系IRBB66为父本进行杂交,杂交后裔之F2 族群各有256单株,分别以STS 、SSR 与CAPS等分子标志针对xa5、Xa7及Xa21等抗病基因进行检测。检测结果显示,试验中所使用的分子标志皆具有可区分而易判别之多型性,在台中籼10 号 × IRBB66 之F2族群中, xa5、Xa7及Xa21等3 个抗病基因连锁之同质结合分子标志基因型个体分别占27.95%、20.88%及24.08%;而在台粳9号× IRBB66 之F2族群中,xa5、Xa7及Xa21的抗病基因连锁之分子标志同质结合基因型个体分别占25.0% 、18.95%及24.28%。各基因型之分布,大部分皆符合孟德尔遗传分离律之比例,唯有Xa7基因在台粳9号× IRBB66 之F2 族群有分离偏差之现象。本试验获得的抗病基因之遗传行为资讯,有助于未来拟定正确的育种策略,且试验采用的分子标志辅助育种试验模式,提供比传统抗病性状调查更明确的选种依据,有助于缩短育种年限,对未来的育种研究工作有良好的应用价值。

    关键字:水稻白叶枯病,Xanthomonas oryzae pv. oryzae ,分子标志辅助育种。

    前 言

    水稻白叶枯病是重要的细菌性传染病,由Xanthomonas oryzae pv. oryzae之感染所引起,经常对台湾的稻作生产造成危害,好发期间为每年的二期作,因近年来台湾经常受到台风侵袭,强风豪雨造成的叶片损伤容易导致病菌之感染,进而导致减产,如何控制白叶枯病之危害是亟待解决的问题。控制作物病害的策略有育成抗病品种、化学药剂控制及调整栽培管理模式等,其中最符合经济效益者为育成抗病品种(1)。研发抗病品种之试验过程中最大的困难为环境因素的影响,以往接菌诱导发病之试验除了费工、耗时之外,特别容易受到气候的干扰而造成性状表现不稳定,导致抗病性状调查困难。另一方面,若抗病性是由2 对以上的基因所控制,亦会造成统计分析上的困难。因此,抗白叶枯病品种之育种需要更稳定的选种模式(11)。

    分子标志辅助育种技术(marker assisted selection, MAS) 是近年来运用于作物育种的重要技术,主要是利用作物基因组中,可被稳定侦测的核酸片段,作为侦测目标基因的工具,目前已有多种作物利用分子标志建构遗传图谱(4,5,9,17,23)。分子标志与目标性状基因之关系,大致上可分为连锁性标志(linkage marker) 与功能性标志(functional marker) 。连锁性标志是指这一类分子标志与目标基因的遗传距离较短,发生互换的机率很低,因此育种家可藉由侦测连锁性标志来掌握目标基因的动向。一般而言,连锁性标志与目标基因的遗传距离若低于5 cM,则可利用于辅助育种。而功能性标志则位于目标基因上,遗传距离为零,辅助选种时可预测性达到百分之百(13)。目前已有超过30个水稻抗白叶枯病基因被发现,分别为Xa1 到xa32(6),本篇报告的研究目标是xa5 、Xa7 及Xa21等3 种抗病基因。 xa5 基因是一隐性抗病基因,Li 等人的研究指出xa5有部分显性效应,并有增强Xa4 及Xa21基因的抗病性的交感效应(15)。 2004年Iyer-Pascuzzi 等的研究指出xa5 编码的蛋白质是一个转录因子的次单位(TRIIAγ)(12,14),Iyer-Pascuzzi 与McCouch并于2007年开发了xa5 的功能性标志(13)。 Xa7 基因为显性抗病基因,Sidhu等人在抗病水稻品系DV85中发现此基因(21),Ogawa 等曾利用回交法将Xa7 基因转移到IR24品系,育成抗病品系IRBB7(18),Porter 等曾定位Xa7 在水稻基因组的位置,并发展Xa7 的连锁分子标志M5(19),因 M5本身不具共显性,辅助选种时无法分辨显性同质结合与异质结合基因型个体,故选种强度较差。 Chen等找到RM20580和RM20595等简单重复序列(simple sequence repeat, SSR) 标志,与Xa7的遗传距离不到0.5 cM ,且具共显性,比M5更适合应用于Xa7 的辅助育种(6),本次试验则同时使用M5、RM20580及RM20595来侦测Xa7,并且比较其选种效率之差异。 Xa21是从野生稻Oryzalongistaminata 发现的显性抗病基因,其编码的蛋白质属于多亮胺酸区域(leucine rich region,LRR)结合蛋白质(20,22),Xa21的连锁分子标志pTA248 是从随机增幅多型性引子RAPD248的PCR 产物设计而来(7),Williams等曾利用pTA248分子标志协助育成具有Xa21的IR24近同源系IRBB21(26)。虽然已有对多种不同生理小种的抗性品系育成,但病菌本身的族群演变速度相当快,每一年度流行的生理小种可能变动,所以选育抗病品种的策略要以堆叠多种抗病基因为目标,才可以维持长期有效的抗性。多种抗病基因的堆叠不仅有助于改进抗病性的「质的性状」,也有助于改进「量的性状」(8,11,15)。所谓「质的性状」是针对不同生理小种的垂直抗性幅度增广,而「量的性状」是指横式抗性增强。本次试验中使用的杂交亲本IRBB66 ,是堆叠Xa4 、xa5 、Xa7 、xa13及Xa21等5 个基因的抗病品系,因此在F2 分离世代会有5 种抗病基因互相排列组合的各种抗病基因型,不仅提供多样化的分离族群作为选种来源,同时也是研究抗白叶枯病基因遗传行为的良好试验材料。本次研究是以良质米品种台中籼10号与台粳9 号为母本而IRBB66 为父本进行杂交,产生此两种杂交组合产生F 2 分离族群后,利用STS (sequence taggedsite) 、SSR (simple sequence repeat) 与CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence)等分子标志检测F2 族群中xa5、Xa7 及Xa21等3 个基因座基因型之分离情形。检测之结果不仅可以作为早57代选种之依据,也可借此了解这些抗病基因的遗传行为,作为未来拟定抗白叶枯病育种选拔策略之参考。

    材料与方法

    参试水稻品种( 系) 与杂交族群

    试验材料中的杂交组合,母本为本场育成之良质米品种台中籼10号与台粳9 号,父本为国际水稻研究所(IRRI) 提供的抗白叶枯病籼稻品系IRBB66 ,IRBB66 具有五种抗病基因之堆叠,分别为Xa4、xa5、Xa7、xa13及Xa21。本试验于99年一期作进行杂交,同年二期作栽培F1,100年一期作栽培F2 族群。为方便标定位置,采用128 孔之穴盘,每穴栽培1 个F2 族群之种子,于三叶龄进行采样,样品为每个单株剪下5 mm的叶片组织,为避免DNA交互污染,每个单株剪叶之间隔以70% 酒精棉花擦拭剪刀,经采样后各样品皆进行xa5、Xa7 及Xa21等3 种抗病基因之分子标志检测。

    萃取核酸与聚合酵素连锁反应

    萃取核酸采用的试剂为Plant Genomic DNA Purification Kit (GeneMark, Taiwan),将叶片组织置于1.5 mL离心管,浸泡于液态氮,以钢珠振荡磨碎之后,按照产品操作手册之步骤进行核酸萃取,已萃取之核酸保存于-20 ℃冰箱备用。聚合酵素连锁反应(PCR) 使用的试剂为Fast-Run Taq Master Kit (Protech Technology, Taiwan),总反应体积为25 μ L ,内含10 mMTris-HCl 、50 mM KCl、0.01% Gelatin、1.5 mM MgCl2 、0.1% Triton X-100、3.75 U Taq DNApolymerase 、1 μ L DNA及0.4 μ M 引子。试验中采用的核酸引子皆由源资国际生物科技股份有限公司合成(Tri-I Biotech, Taiwan) ,反应仪器为GeneAmp PCR System 9700 (AppliedBiosystems, USA) ,反应温度及反应时间依各分子标志之不同而调整。抗病基因xa5 之检测使用Iyer-Pascuzzi 与McCouch开发的CAPS标志(13),其原理是利用限制酵素BsrI 或Sml I 切割xa5 基因序列的PCR 产物,利用切割后的核酸片段多型性分辨抗病与感病基因型。 PCR 反应条件为94℃ 3 分钟,接着循环33次94 ℃ 30 秒、50℃ 30 秒、72℃ 60 秒。最后是72℃ 5 分钟。PCR 引子序列如下:F:5"-GATAGCAGCATTTCCAAGAG-3" ;R:5"-GATTCCTTTAGCAAGGTGTG-3’。切割酵素采用BsrI (New England Biolabs, UK),操作过程按照产品使用说明书。完成限制酵素切割反应后以2%琼脂胶(Agarose I, Amresco, USA) 进行电泳分析。抗病基因Xa7 之检测在台中籼10号× IRBB66之F 2 族群使用M5及RM20595两种分子标志,在台粳9 号×IRBB66 之F2族群则使用M5及RM20580,以上3 种分子标志都是进行PCR 增幅后直接以电泳分析核酸片段大小,引子序列如下:M5F:5"-CGAT CTTACTGGCTCTGCAACTCTGT-3" ;M5R:5"-GCATGTCTGTGTCGAT TCGTCCGTACGA-3",PCR 条件为94℃ 5分钟,接着循环30次94℃ 30 秒、55℃ 30 秒、72℃ 60 秒,最后是72℃ 5分钟。 RM20595之序列为F :5’-AACTTCCTTTCCAGGCTTTCAGC-3’。 R :5"-TTCACTGAGCCTGAACACATT GC-3",PCR 反应条件为94℃ 5分钟,接着循环35次94℃ 30 秒、60℃ 45 秒、72℃ 60 秒。最后是72℃ 5分钟。电泳时M5之PCR 产物采用1.5%琼脂胶(Agarose I, Amresco, USA) 进行电泳分析,而RM20595及RM20580以3%高解析度琼脂胶(SFR Agarose, Amresco, USA) 进行电泳分析。抗病基因Xa21之检测针对Xa21基因,采用的分子标志为pTA248,序列为F:5"-AGACGCGGAAGGGTGGTTCCCGGA-3";R :5"-AGACCGGTAATCGAAAGATGAAA-3",PCR 反应条件为94℃ 5分钟,接着循环30次94℃ 30 秒、55℃ 30 秒、72℃ 60 秒。最后是 72℃ 5分钟。 PCR 增幅产物直接以1.5%琼脂胶(Agarose I, Amresco, USA) 进行电泳分析。

    结 果

    一、各分子标志之多型性测试

    以CAPS检测xa5 基因座之结果如图一所示,分别以IRBB66 、台粳9 号、台中籼10号、台粳9 号× IRBB66之F 1 、台中籼10号× IRBB66之F 1 进行PCR 及限制酵素切割反应之结果,依序分别为Lane 1 到Lane 5 ,由图中可轻易判别抗病型同质结个体的PCR 产物为850 bp ,无法以BsrI 限制酵素切割因此只有一个条带,而感病型同质结合个体的PCR 产物经BsrI 限制酵素切割后,形成300 bp 及550 bp 两个条带。而异质结合之F 1 个体则有850 bp 、300 bp 及550 bp 三个条带。 

    以M5标志检测Xa7 基因座之结果如图二所示,Lane 1 至Lane 5 依序为IRBB66、台粳9 号、台中籼10号、台粳9 号× IRBB66之F 1、台中籼10号× IRBB66之F 1,M5标志不具共显性,因此抗病型同质结合个体与异质结合个体的PCR 产物的条带大小为300 bp,感病型同质结合个体在300 bp 处则无条带。 

    以SSR 分子标志检测Xa7 基因座之结果如图三所示,Lane 1 至Lane 3 依序为IRBB66 、台粳9 号以及台粳9 号× IRBB66之F1,采用RM20580标志之引子进行PCR ,产物大小分别为抗病型同质结合个体80 bp、感病型同质结合个体95 bp,而异质结合之F 1 个体则兼具80 bp、95 bp以及出现在110 bp 的不规则杂合条带。 Lane 4 至Lane 6 依序为IRBB66 、台中籼10号以及台中籼10号 × IRBB66之F1 ,采用RM20595标志之引子进行PCR ,产物大小分别为抗病型同质结合个体170 bp 、感病型同质结合个体130 bp ,而异质结合之F 1 个体则兼具170 bp 、130 bp 以及出现在190 bp 的不规则杂合的条带。 

    以pTA248分子标志检测Xa21基因座之结果如图四所示,Lane 1 至Lane 5 依序为IRBB66、台粳9 号、台中籼10号、台粳9 号× IRBB66之F 1、台中籼10号× IRBB66之F 1。抗病型同质结合个体PCR 产物大小为950 bp,感病型同质结合个体PCR 产物大小为台粳9 号的750 bp或台中籼10号的650 bp ,而异质结合之F 1 个体则兼具950 bp 及750 bp 之条带或兼具950 bp 及750 bp 之条带。从图一到图四的结果可发现,此4 个分子标志皆具有明显的多型性,各基因型之差异皆可轻易判别。 

    二、台中籼10号 × IRBB66之F2 族群xa5 、Xa7 、Xa21抗病基因型之分布。以CAPS分子标志检测xa5 基因之结果如表一所示,在F 2 族群之254 个有效资料中,抗病型同质结合个体为71个(27.95%) ,异质结合个体为128 个(50.39%) ,感病型同质结合个体为55个(21.65%) ,经卡方适合性分析,符合孟德尔遗传分离律1:2:1之比例。χ2 = 2.03 < 5.99 (critical χ2, α = 0.05, df = 2)表中所有个体的位置皆符合幼苗在穴盘之实际位置,3 种基因型以不同颜色区分,以便利辅助育种之进行。

    以M5分子标志检测Xa7 基因之结果如表二所示,F2 族群之255 个有效资料中,抗病型同质结合个体与异质结合个体总数为185 个(72.55%) ,感病型同质结合个体为70个(27.45%) ,经卡方适合性分析,符合孟德尔遗传分离律3:1之比例。61χ2 = 0.82 < 3.84 (critical χ2, α = 0.05, df = 1)

    以RM20595分子标志检测Xa7 基因之结果如表三所示,F2 族群之254 个有效资料中,抗病型同质结合个体为51个(20.88%) ,异质结合个体为126 个(51.41%) ,感病型同质结合个体为71个(28.51%) ,以卡方适合性分析,符合孟德尔遗传分离律1:2:1之比例。χ2 = 3.28 < 5.99 (critical χ2, α = 0.05, df = 2)

    以pTA248分子标志检测Xa21基因之结果如表四所示,F 2 族群之254 个有效资料中,抗病型同质结合个体为59个(24.08%) ,异质结合个体为120 个(48.98%) ,感病型同质结合个体为66个(26.94%) ,以卡方适合性分析,符合孟德尔遗传分离律1:2:1之比例。χ2 = 0.96 < 5.99 (critical χ2, α = 0.05, df = 2)

    二、台粳9 号x IRBB66 之F2 族群xa5 、Xa7 、Xa21 抗病基因之分布。

    以CAPS分子标志检测xa5 基因座之结果如表五所示,在F2 族群之244 个有效资料中,抗病型同质结合个体为61个(25%) ,异质结合个体为125 个(51.23%) ,感病型同质结合个体为58个(23.77%) ,经卡方适合性分析,符合孟德尔遗传分离律1:2:1之比例。χ2 = 0.22 < 5.99 (critical χ2, α = 0.05, df = 2)

    以M5分子标志检测Xa7 基因座之结果如表六所示,F2 族群之255 个有效资料中,抗病型同质结合个体与异质结合个体总数为164 个(66.13%) ,感病型同质结合个体为84个(33.87%) ,经卡方适合性分析,不符合孟德尔遗传分离律3:1之比例,有偏差分离(bias distribution) 之现象。χ2 = 10.41 > 3.84 (critical χ2, α = 0.05, df = 1)

    以RM20580分子标志检测Xa7基因座之结果如表七所示,F2 族群之254 个有效资料中,抗病型同质结合个体为47个(18.95%) ,异质结合个体118 个(47.58%) ,感病型同质结合个体为83个(33.47%) ,以卡方适合性分析,不符合孟德尔遗传分离律1:2:1之比例,有偏差分离之现象。χ2 = 11.03 > 5.99 (critical χ2, α = 0.05, df = 2)

    以pTA248分子标志检测Xa21基因座之结果如表八所示,F 2 族群之254 个有效资料中,抗病型同质结合个体为59个(24.28%) ,异质结合个体为111 个(45.68%) ,感病型同质结合个体为73个(30.04%) ,以卡方适合性分析,符合孟德尔遗传分离律1:2:1之比例。χ2 = 3.43 < 5.99 (critical χ2, α = 0.05, df = 2)

    讨 论

    世界各国利用分子标志进行辅助育种的研究已行之有年,现今大部分的分子标志皆以聚合酵素连锁反应(PCR) 为基础,其中包括逢机扩增片段多型性DNA (random amplifiedpolymorphic DNA, RAPD)(27)、简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)(28)、扩增片段长度多型性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)(25),每一种分子标志皆有不同的特性及优缺点,目前应用最广泛之种类为SSR ,其主要原因是SSR 在基因组中数量多、具有丰富的多型性、再现性高及具共显性等优点,适合利用于建构遗传图谱、基因定位,以及辅助育种。SSR 在早期难以应用是因为两端的引子序列不易获得,必须经过多次设计与测试,耗费大量时间、金钱,但今日各国学者已累积数量相当大的SSR 引子资讯资料库,使SSR 可利用性大增(24)。本次试验中所使用的分子标志中,用于侦测Xa7 的有RM20595、RM20580以及M5,其中RM20595、RM20580属于SSR 分子标志,试验结果显示RM20595及RM20580因为距离Xa7 基因较近且具共显性,因此在应用时有良好的判别性。 M5同样是侦测Xa7 的标志,由于没有共显性无法判别显性同质结合与显性异质结合个体,因此选种效率较差。

    分离偏差是指杂交后代分离族群中,基因型或外表型之分布不按照孟德尔分离律的情况,McCouch等发现爪哇稻和籼稻的杂交分离族群基因组偏向籼稻(16),而He等人发现籼稻与粳稻杂交分离族群基因组同样会偏向籼稻(10)。本次研究的试验结果中,在台粳9 号×IRBB66 的F2分离世代则发现Xa7 的分布偏向台粳9 号,若按照孟德尔分离律,应有25% 抗病型同质结合之个体,但实际上只有18.95%,感病型同质结合个体却高达33.47%,这种情形在同一杂交组合的xa5 、Xa21基因并无发现。分离偏差发生的原因可能与以下几个因素有关:1. 小孢子发育不良;2. 大孢子发育不良;3. 特定配子基因型在受精作用时的竞争作用;4. 双亲的亲缘关系远近;5. 不同染色体之差异;6. 同一染色体的特定区域(2)。了解遗传行为对育种选拔策略之拟定可提供有利讯息,例如本次试验中发现的Xa7 之分布偏向感病性基因型,若不是以分子标志辅助选种,入选的子代数量可能太多导致选种强度过低,易造成选种效率低落。曾有研究指出台中籼10号x 越光的F2 族群中,第6 对染色体的基因组成明显偏向母本,并且推测籼稻与粳稻杂交重组之后代基因型可能偏向籼稻型(2),此一结论与本次研究之试验结果不符。本次试验是以台粳9 号为母本,籼稻型的IRBB66 为父本,在第6 对染色体上的Xa7 基因座,在F2族群之分布偏向台粳9 号之基因型,由此现象可判断,母本的基因型可能才是分离偏差的主要决定因素。第6 对染色体的分布主要为偏向母本型,而非偏向籼稻型或偏向粳稻型。国内已有不少的植物分子标志相关研究报告,但实际应用于育种工作的报告较少,主要是因为新的育种模式不易建立,另一方面,兼具育种学知识与分子生物学基础的之研究人员较少。分子标志辅助选种(MAS) 的模式在先进国家已被成功应用,这年来也有不少优良品种被育成,同样地,MAS技术在国内也被认为是重要的农业科技研发方向。若要实际应用MAS在育种试验中,从育苗、采样到分子生物学实验的检测都必须小心设计,以防止动辄上千株之试验材料产生混淆。根据本次研究的经验,育苗的装置必须与聚合酵素连锁反应的96孔盘互相对应,例如市面上常见的8 × 16穴盘颇为适用。萃取核酸时因数量庞大,应采用自动化设备,例如钢珠研磨均质机或自动萃取核酸之仪器。进行电泳时,可采用八爪分注器大量分注样品,应采用大型电泳槽,每次分析的样品数应该在100 个以上。试验结果之记录表也应符合育苗盘之位置,并使用不同鲜明颜色表示不同基因型,进行选取植株与移植工作时就比较容易区分,期望这些操作经验可以提供往后进行MAS之育种工作者参考。

    作物品种育种研发成本相当高,以时间成本而言,育成作物品种大约需要8~10年,以经济成本而言,平均每个作物品种研发成功大约需要花费新台币2 千万元(3)。采用分子标志

    技术辅助育种试验之进行,可缩短育种年限,减少育种过程需耗费的时间与金钱,为国家节省大量资源,此外,育种年限的缩短有助于及时育成抗逆境作物品种,以利因应气候变迁可能造成的作物栽培逆境,例如耐干旱、耐高温以及抗病品种。未来我们将持续致力于导入分子标志技术于育种试验中,以增强品种研发动能,加速品种产出效率,创造农民福祉。   


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