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   固杀草(Glufosinate)诱导水稻微芽分化及其衍生植株耐性之研究





    
    
    
    摘 要
    
    固杀草为非选择性除草剂,可控制多数阔叶杂草。本试验以TNG67、FSK、Koshihikari、R11-2及R11-3等五个品系水稻为材料,于培养基中添加不同浓度固杀草,观察能否诱导微芽大量生成,结果显示,上述水稻幼芽经2.5×10-7 M固杀草培养基培养14天后,继代至2.5×10-6 M固杀草培养基中30天后发现,R11-2及R11-3有较佳之微芽诱导效果,分别可产生216及120个微芽。试验将两阶段诱导衍生之植株移植温室,藉由喷施2.6×10-4 M固杀草,探讨其对固杀草耐感性表现,结果显示,衍生植株在叶绿素及铵累积反应上,具有耐感差异;为探讨此耐感差异产生之原因,试验进一步利用14C-glufosinate处理植株,经TLC分析及14C同位素放射活性测定,发现在叶绿素及铵累积反应上为耐性之植株,其固杀草代谢物占同位素放射总量显著高于感性植株,因此,推测微芽衍生植株对固杀草耐感性差异为其代谢能力所致。
    
    关键字:水稻、固杀草、微芽分化。
    
    前 言
    
    1994年初,德国Hoechst 及Schering两家公司共同组成之农化公司AgrEvo研发出之固杀草(glufosinate)除草剂,其铵盐形式为ammonium DL-homoalanin-4-yl (methyl) phosphinate(IUPAC),为非选择性萌后接触型除草剂,可控制多数的一年生禾草和阔叶杂草,主要针对果园、蔬菜田及不整地玉米田之杂草防除(21)。
    
    固杀草为有机磷化合物,拜耳(Bayer)公司制造之百试达(Basta),为水蓝色液体,含有13.5%之有效成分。一般土壤对固杀草的吸附力弱,故淋洗较强,且可快速被微生物分解成不具植物毒性的3-methlphosphincopropionic acid (MPPA-3)(16,18),在土壤中的半衰期约为5~10天,其毒性极低,对成鼠的口服急毒性半致死剂量(LD50)为2,000 mg/kg。目前台湾市售之固杀草登记用于香蕉、木瓜等果园,胡瓜、洋香瓜等蔬菜田及非耕地之杂草防除,于杂草生长旺盛至开花前使用(1)。
    
    固杀草之作用机制主要是抑制植体中glutamine synthetase (GS; EC 6.3.1.2)酵素活性(9),因为固杀草系一类似glutamate的化合物,会与glutamate竞争GS的作用位置(10)。 GS分别存在于细胞质及叶绿体中,是催化氮素代谢的必要酵素,其可将glutamate与铵基结合形成glutamine,酵素受到抑制时会造成铵的累积。例如狐尾草(green foxtail; Setaria viridis)施用固杀草后叶片上的铵量会增加100倍以上(14,21)。通常在喷施固杀草3至5天内会有伤害征状出现,尤其在光照下铵累积更明显增加,过量的铵会造成细胞膜崩解、抑制光合作用及导致植株死亡(2,19)。
    
    Toldi et al.以水稻为材料,利用glufosinate ammonium (phosphinothricin, PPT)诱导产生微芽(microshoot),并移植至温室喷施固杀草,发现经PPT诱导所产生之植株对固杀草有耐性的表现,而未经PPT诱导产生之植株,则全部黄化死亡(17);此外,亦发现温室所产生的对照组R1种子,于含有3.5 mg/L PPT的培养基中,没有种子发芽,然而经过PPT诱导的小苗,其产生的R1种子则有78.4%的发芽率。 Pornprom et al.以大豆幼苗胚轴细胞为材料,利用渐进提高glufosinate浓度方法之悬浮培养,发现也能获得对glufosinate具耐性之植株(13)。
    
    植物能将L-glufosinate经转胺基作用生成中间代谢物2-oxo-4-(hydroxymethylphosphinyl)butanoic acid (PPO) , PPO 会快速地经去羧化(decarboxylated) 生成稳定的代谢物3-(hydroxymethylphosphinyl)propionic acid (MPP)(5);PPO也可由另一途径还原成少量的2-hydroxy-4--(hydroxymet- hylphosphinyl) butanoic acid (MHB),MHB在细胞培养中可代谢成4-(hydroxymethylphosphinyl) butanoic acid (MPB)。 Jansen et al.调查20种植物的切离根及叶部对固杀草的代谢,发现此20种植物其主要代谢物均为MPP (占2.4~18.8%),其中有14种植物具有少量的MHB (0.2~9.6%),但未侦测到中间产物PPO(7)。 Pline et al.利用TLC分析耐性藜草、决明子(sicklepod; Cassia obtusifolia)、马利筋(milkweed; Asclepias syriaca L.)和感性大狗尾草(beauv; Setaria viridis L.)对固杀草的代谢作用,发现感性植株并无代谢物产生,而耐性藜草则有固杀草的代谢物MPP(12),显然此试验中有些耐性杂草可能具有代谢固杀草的能力,而减少伤害程度。
    
    本试验以5个不同水稻材料,包括台农67号(TNG 67)、富士光(FSK)、越光(Koshihikari),以及台农67号突变体R11-2及R11-3为材料,利用低浓度固杀草诱导水稻产生微芽,观察不同水稻材料诱导微芽产生之表现,并进一步探讨微芽衍生植株对固杀草之耐感性表现及作用机制。
    
    材料与方法
    
    一、试验材料
    
    本试验采用TNG 67、FSK及Koshihikari 水稻品种,及行政院农业委员会农业试验所分子遗传研究室提供,经叠氮化钠(NaN3)诱变TNG67获得之R11-2及R11-3为试验材料。试验中使用之固杀草,为拜耳作物科学股份有限公司生产之商品13.5%百试达溶液。本试验添加至培养基之浓度分别为0、2.5×10-9、2.5×10-8、2.5×10-7、2.5×10-6M等5种。
    
    二、水稻微芽诱导效果之建立-第一阶段
    
    水稻种子在脱壳后,先经70%之乙醇震荡清洗1分钟,共2次,再利用2%及1%之次氯酸钠(sodium hypochlorite)各震荡10分钟,然后经无菌水冲洗3次后,将种子的胚朝上,种至含有MS固态培养基的试管中,将种子埋入培养基中约5 mm,待其发芽达5~8 mm时(约3~5天),从子叶盘处将芽切下,移植至分别含有0、2.5×10-9、2.5×10-8、2.5×10-7、2.5×10-6 M固杀草但不含荷尔蒙的培养基中,每试管种植4颗芽,在培养3、7及14天后调查生长反应,包括株高、发根与否、叶片伤害指数,以及微芽诱导效果。
    
    1.培养基配置
    
    无菌播种培养基主要为MS培养基,并添加30 g/L蔗糖,再以1 N KOH将pH值调至5.7后,再添加2 g/L活性碳(charcoal)及6.5 g/L agar gel。配制完成后分装至每支试管7.5 ml,放入121℃、1.25 kg/cm2灭菌釜灭菌20分钟,完成后取出试管直立,待其冷却凝固备用。
    
    2.生长及微芽诱导效果之调查
    
    将水稻幼芽移植至含不同浓度固杀草之MS培养基后3、7及14天,分别调查株高、发根状况及微芽诱导效果,株高为试管中水稻小苗地上部高度,发根状况则以小苗根系产生与否为依据,微芽诱导效果则是调查水稻小苗是否有新的分蘖产生。
    
    3.水稻伤害指数等级之建立
    
    伤害指数(injury index)之调查是水稻小苗在处理含有5种不同浓度glufosinate之培养基后,分别于3、7及14天时观察小苗外表伤害变化,并分级记录其伤害程度。本研究根据小苗枯黄、卷曲、坏疽及褪绿等不同程度之伤害,订定五种不同指数植之伤害,其中0代表水稻幼苗鲜绿健康未发生药害,5代表植株已完全死亡(3)。
    
    三、诱导效果之建立-第二阶段(继代培养)
    
    将第一阶段培养14天之水稻小苗在距离基部8 mm处切下,继代至含有2.5×10-6 M固杀草培养基中,在第14及30天调查生长反应及微芽诱导效果。之后将水稻微芽从距离基部8 mm处切下,再次继代至MS培养基中培养14天后,分株分群移至穴盘,并在生长箱中生长7天,接着移植至温室,作后续之幼苗测试及收获种子。
    
    四、固杀草诱导产生之微芽对除草剂之耐性变异
    
    1.伤害指数将试管诱导产生之微芽所培育长成之水稻植株移植至温室,待其生长两周后,喷施7.5×10-4 M固杀草,调查第7、14及21天叶片之伤害指数,每个水稻材料皆以伤害指数为依据,挑选出耐感植株各4株。
    
    2.铵累积量水稻材料于温室中经由喷施固杀草筛选之结果,挑选出耐感植株各4株,并以TNG 67为对照组进行铵累积测定。待水稻幼苗生长至分蘖期时,取植株之完全展开叶之叶片片段(约1 cm)放至培养皿中,培养皿中加入5 ml、2.6×10-4 M固杀草溶液,24 hr后分析铵累积量。分析方法仿D"Halluin et al.之方法(4)经部份修改而成,秤取上述剪下之叶片重量,加入少许海砂及适量液态氮将组织磨碎,加入500 μl内含25 mg PVPP (polyvinyl polypyrrolidone)之水溶液在冰浴状态下均质,之后吸取300 μl研磨液至离心管中,在4℃、12,000 g下离心15秒。之后取100 μl澄清液加300 μl蒸馏水稀释,震荡均匀后再从中取30 μl,加入100 μl试剂A [内含5 g酚(phenol)、25 mg硝普化钠(sodium nitroprusside)、500 ml蒸馏水和100 μl试剂B [内含2.5 g NaOH、1.6 ml次氯酸钠(sodium hypochlorite,含13%可利用氯)、500 ml蒸馏水,将混合液置在37℃下15分钟,利用ELISA reader 在630 nm波长下读取吸光值。分析中以0.1~2.0 μg NH4+-N (3.82 g NH4Cl =1 g NH4+-N)浓度范围内之NH4Cl,作出标准检量线并估计样品中铵的含量。
    
    3.叶绿素含量
    
    待水稻幼苗长至分蘖期时,取植株之完全展开叶之叶片片段(约1 cm)于处理固杀草前,利用portable chlorophyll meter (SPAD-502, Minolta Co. Ltd)测试叶片片段之叶绿素色度,接着将叶片片段置入培养皿中,并加入5 ml、2.6×10-4 M固杀草溶液于底部滤纸上,24 hr后再将叶片片段取出以吸水纸吸干其表面水分,再次测试叶片片段之叶绿素色度,观察在固杀草处理24 hr下,水稻叶片片段叶绿素之下降比例。
    
    五、微芽衍生植株耐固杀草之机制
    
    本试验利用耐感性差异幅度最大的富士光衍生植株,配合对照组TNG 67,施用10 μl14C-glufosinate (2,000 Bq/μl)(内含0.1% Tween-20),均匀涂抹于水稻植株完全展开叶之中段1cm叶片上。水稻叶片在处理24 hr后取样,处理片段先以1 ml蒸馏水洗去外表未吸附之14C-glufosinate,之后将叶片处理片段剪碎后,加入少许液态氮研磨后,加入2 ml 甲醇均质萃取,滤液放入离心管中于90℃下静置5分钟以沉淀蛋白,于13,000 g下离心5分钟,取其澄清液以真空浓缩机(Model Speed Vac SC 200, Savant Instruments, Inc., 110-103 Bi-County Bivd.,Farmingdale, NY11735)浓缩至干,再以80%乙醇定量至200 μl。分析时取植体萃取浓缩液5 μl及1 μl 14C-glufosinate与其代谢物14C-3-(hydroxymethylphosphinyl) propionic acid (MPP)点在TLC (Thin layer chromatography)平板上(Silicagel, 60A. LK6F-254 EM reagents TLC plates,Whatman Lab sales, Inc., Hillsboro, OR97124)之后置入展开槽中,展开槽内的展开液为isopropyl alcohol:acetic acid:H2O (2:1:1, v/v/v)混合液,约展开7 hr后取出风干,之后将TLC平板和X-ray底片(BioMaxTM MS, Eastman Kodak)共同压片,利用自动放射显影术,经5天后可以在TLC平板上显现14C标定之固杀草及其代谢物,并计算其Rf值(12)。测定14C同位素放射活性时,先将TLC平板上不同Rf值之固杀草及其代谢物,以小刀刮下加入1 ml 甲醇震荡混合,于室温下静置18 hr后于18,000 g离心5分钟,将澄清液放入闪烁计数瓶(6 ml, min poly-QTM vial, Beckman Co. Ltd),再加入5 ml cocktail solution (Ready safeTM;Beckman Co. Ltd)于室温下经48 hr充分反应后,以闪烁计数仪(Liquid scintillation counter;LS-6000 IC, Beckman Co. Ltd.)测定14C同位素放射活性。
    
    结果与讨论
    
    一、固杀草对水稻微芽诱导效果之比较
    
    为抑制水稻小苗生长,促进微芽产生,试验以TNG67、FSK、Koshihikari、R11-2及R11-3等5个水稻为材料,于诱导系统第一阶段培养基中添加2.5×10-6 M固杀草,处理3天后,地上部生长抑制达45~73%,第7天,地上部抑制情形已达81~89%,且以FSK最高,其次为Koshihikari与R11-2,第14天地上部抑制情形则以FSK及R11-2最严重,达91及92%;在伤害指数方面,Koshihikari、R11-2及R11-3于第7天时达1.2至1.4,第14天时越趋严重,达1.8至2.5;试管中幼苗发根情形则与地上部生长抑制有相同趋势,其中以第14天Koshihikari发根率最差,仅余65%(表一);综合上述试验发现,诱导系统第一阶段处理2.5×10-6 M固杀草可显著抑制试管中水稻小苗生长及发根率,且造成不同程度的药剂伤害,但因未有微芽产生,于是试验将上述小苗皆继代至2.5×10-6 M固杀草的培养基中,进行第二阶段诱导,观察后续是否能有微芽产生。
    
    试验将TNG67、FSK、Koshihikari、R11-2及R11-3等5个水稻材料第一阶段培养至14天之小苗在距离基部8 mm处切下,将根完全切除并继代至含有2.5×10-6 M固杀草培养基中,观察其微芽诱导效果。根据表二显示,经第二阶段诱导14天后,除FSK以外,其余品系皆已有微芽产生,其中R11-2与R11-3有较佳之微芽诱导效果,分别有108及96个微芽产生,微芽产生率为62~64%,经第二阶段诱导30天后,5个水稻品系皆有微芽产生,其中以R11-2有最佳的微芽诱导效果,约有216个微芽产生,微芽产生率约78﹪,且其母株存活率达100%,诱导效果最差为FSK,仅有12个微芽产生,母株存活率仅17% (表二),图一即显示此5品系水稻经第二阶段诱导30天后之微芽诱导效果。 Toldi et al.以水稻为材料,发现以2 mg/L PPT有最佳的微芽诱导分化效果,然而本试验所用之固杀草浓度较该研究为低,但仍能有效地促进微芽诱导产生(17)。
    
    二、固杀草诱导产生之微芽其衍生植株对固杀草之耐性变异
    
    试管诱导产生之水稻植株历经驯化、移植及喷施固杀草筛选耐感植株后,置于温室中待植株恢复生长,俟植株生育至分蘖期,取其完全展开叶之叶片片段(约1 cm长)放至培养皿中,处理5 ml、2.6×10-4 M固杀草24 hr,分析其铵累积及叶绿素含量,结果显示,经固杀草处理之5品系水稻耐感植株叶片,其叶绿素相对对照组皆呈下降趋势,且以感性R11-2下降比例最高,达26.2%;在铵累积上,则以感性TNG67累积量最高,达8.2 mg/g.Fw;试验同时发现,TNG67、FSK、R11-2感性植株在铵累积量及叶绿素下降比例中,皆显著高于其耐性植株,Koshihikari及R11-3虽未达显著差异,但仍具感性植株高于耐性植株之相同趋势(表三),由此得知,经固杀草诱导可产生不同耐感性植株,且其叶绿素及铵累积反应亦与其耐感性表现有相同趋势。
    
    三、微芽衍生植株对固杀草耐性变异之可能原因
    
    试验以经喷施7.5×10-4 M固杀草,并配合伤害指数筛选出之耐性FSK与感性FSK及对照组TNG 67植株为材料,利用10 μl 14C-glufosinate (2,000 Bq/μl)(内含0.1% Tween-20)标定处理,在处理24 hr后取样洗去外部未吸收之除草剂,将植株萃取液浓缩点在TLC平板上,约展开7~8 hr后取出风干,风干后将含有14C-glufosinate之TLC平板和X-ray的底片共同压片,利用自动放射显影,经5天后可显现14C-glufosinate (Rf: 0.20)、unknown metabolite (Rf: 0.34)及其代谢物MPP(Rf: 0.55)之位置(图二)。由图二得知,耐感性品系均有代谢物MPP生成,但无法由图判断其含量,因此,试验进一步取下此3种成分,利用液态闪烁计数仪分析平板上固杀草、未知代谢物及固杀草代谢物的放射活性,以确认造成耐感性差异的原因是否与代谢有关。
    
    本试验将TLC平板上固杀草、固杀草未知代谢物及其代谢物刮下,以甲醇溶解后离心,取其上层液以闪烁计数瓶收集,加入cocktail solution反应后,以液态闪烁计数仪测定14C同位素放射活性。试验结果发现,耐感性植株对固杀草皆具有代谢能力,但在耐性FSK植株所测得之固杀草代谢物占同位素放射总活性46%,显著大于感性FSK植株所测得之固杀草代谢物20%,由此推测耐性FSK与感性FSK对固杀草之耐感差异原因,可能与其对固杀草代谢活性的差异有关(表四)。
    
    有关固杀草代谢与耐性之间的关系,Jansen et al.调查20种植物切离根及叶部对固杀草的代谢能力,其中篷子菜(yellow bedstraw; Galium verum)的代谢量最高,但其伤害征状最为严重;而代谢量最小的反枝苋(redroot pigweed; Amaranth retroflexus L.),其植物毒害反而轻微(7)。
    
    另外,Skora Neto et al.分析苍耳、牵牛花和白竹仔菜三种感性杂草对固杀草的代谢能力,结果发现不论是处理叶片或根部,三种敏感性不同的杂草皆无代谢物生成(15)。 Kumaratilake et al.及Mersey et al.发现大麦及黑麦田中难以控制之杂草如牛筋草(goose grass; Eleusine indica)及马唐草(large crabgrass; Digitaria sanguinalis),对固杀草具有较低转运能力但具较高代谢能力之特性(8,11);在Everman et al.探讨经基因转殖之抗固杀草玉米、牛筋草、马唐草及决明子(Sicklepod; Senna obtusifolia)对固杀草吸收、转运、代谢表现上亦发现,杂草对固杀草代谢能力在其抗性表现上扮演很重要的角色(6)。至于Pline et al.分析耐感杂草发现,感性植株并无代谢物产生,而在耐性藜草则有固杀草代谢物MPP(12)。显然,本试验与上述研究有类似结果,发现耐性FSK对固杀草具有较佳代谢能力。


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