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   丁基拉草施用于稻田对可培养性固氮细菌族群变化之影响





    
    
    
    摘 要
    
    丁基拉草的施用可提升土壤固氮能力,为进一步了解丁基拉草的施用与土壤固氮细菌族群的关系,并筛选丁基拉草施用下之可培养固氮细菌,本研究施用10倍推荐量的丁基拉草于稻田土壤中,并于不同水稻生长时期测量土壤固氮活性的变化,之后分析可培养性固氮细菌数量的变化、分离筛选型态及16S rDNA编码相异之可培养之土壤固氮细菌菌株。结果显示,丁基拉草的施用造成土壤固氮量上升,尤其以孕穗期时之下层土壤其增加量最大。但于水稻成熟期时,上下层土壤固氮能力与对照组相较各增加7.20%及3.40%,显示一次施用丁基拉草的情形下,土壤固氮能力可于水稻生育期间持续提升。分析土壤固氮细菌族群数量结果显示,于孕穗期时(约为水稻移植后39天),固氮菌数量有显著的上升。自控制组及处理组之稻田土壤中筛选出α-、β-及γ-变形菌门、厚壁菌门及放线菌门之可培养性固氮菌。比较两组样品所筛选出之菌株,发现无论在上层或下层土壤中,其族群组成亦有差异。因此,施用丁基拉草不但可以增加土壤游离性固氮菌的数量,并可改变其族群组成,两者同时可能为造成土壤固氮能力上升的原因。
    
    关键字:丁基拉草、固氮细菌、稻田。
    
    前 言
    
    丁基拉草(Butachlor)(图一),化学名为N-butoxymethyl-2-chloro-2", 6"-diethylacetanilide,是具选择性的系统性除草剂,于1971年引进台湾,为台湾使用最广泛的水田除草剂。本剂的水溶性低,土粒附着力强,故土壤渗漏作用轻微,淋溶深度很少超过1~2 cm(1)。欲防除插秧前杂草,每公顷田地可施用5%的丁基拉草粒剂30 kg(相当于1.5 g are-1的丁基拉草标准品),可防治水稗、鸭舌草、球花蒿草、母草、红骨草、牛毛毡及萤蔺等水田杂草(2)。
    
    前人研究中,将丁基拉草施用于稻田,可有效防除杂草及增加稻米产量,但施用丁基拉草的土壤,不论是其微生物菌相,或是其酵素活性均受到影响(21)。 Min等人于稻田中施用丁基拉草,发现放线菌数量显著减少,而细菌及真菌的数量增加(15)。 Quesada等人的研究显示,稻田中生物固氮作用(Biological Nitrogen Fixation)每作每公顷可贡献75 kg的氮素(18);而于培养基中,每公顷亦可贡献相当于8到30 kg的氮素。由于其效能甚高,固氮作用为许多科学家所欲积极开发与应用的标的。
    
    Mishra及Pandey发现100 mg mL-1的丁基拉草虽然不会使蓝绿菌Nostoc linckia的生长及固氮活性产生改变,却会使其吸收NO3-及NH4+的能力下降(16)。 Jena等人的研究显示,低浓度的丁基拉草可促进固氮酵素活性(12)。 Patnaik等人于每公顷农地施用1.8 kg的丁基拉草,发现固氮酵素的活性有些微提升(17)。 Min等人施用不同浓度(5.5、11及22 mg kg-1)的丁基拉草于稻田中,发现固氮酵素活性于施用初期即提升,且施用浓度越高,其还原力越高;但在一个月后,其活性即受抑制,且浓度越高者抑制情况越显著(15)。显示丁基拉草的施用的确可能对固氮菌的生态或其活性产生改变。
    
    由前人研究可知,固氮细菌的族群及其相对应的土壤固氮活性受到丁基拉草施用的影响,但其原因则有待探讨。本研究的目的即在分析除草剂丁基拉草施用下稻田土壤固氮活性及可培养之游离固氮细菌种类的变化,以了解其间的关系。
    
    材料与方法
    
    水稻种植及实验处理
    
    种植台粳9号水稻(Oryza sativa)于日温30℃,夜温25℃,相对湿度75~90%之人工气候室(Pytotron)中。实验开始前于1/5000华格纳钵(Wagner"s Pot),各3.5 kg的土壤样品(约15 cm高)中各添加基肥:240 kg ha-1硫酸铵((NH4)2SO4)、200 kg ha-1过磷酸钙(主要成分为Ca(H2PO4)2及CaSO4·2H2O)及120 kg ha-1氯化钾(KCl)并与土壤样品混合拌匀,之后于盆栽中添加灌溉水至其较土表高3~5 cm处。发芽约15天的水稻幼苗于丁基拉草施用后一天由苗床移植到华格纳钵中,每钵三株,单本植。处理为不添加丁基拉草之对照组及添加10倍推荐用量(15 g are-1)丁基拉草处理。施用方法为于10 g土壤中添加20 mL去离子水,并加入相当浓度的丁基拉草,剧烈震荡混合后均匀施用在含有3 kg土壤样品的华格纳钵表面。分别于下列时间点采集土壤样品:7、37、67及100天,大约对应于水稻之成活期、孕穗期、开花期及成熟期。土壤样品采集时分为上层0~3 cm及下层3~15 cm分别采取,每种处理三重复。丁基拉草施用于稻田对可培养性固氮细菌族群变化之影响3固氮活性测定本研究由乙炔还原量代表固氮活性(3),实验方法并经修改(19)。秤取10 g土壤样品于30 mL样品瓶中,之后添加0.5%葡萄糖溶液,并搅拌均匀。将上述样品瓶以矽胶塞密封后,以针筒抽取上部10%之空气,并以乙炔气体置换之。于30℃下孵育上述样品24 hr,之后以GC-FID(China Chromatography GC9800, China)测量乙烯的生成量。 GC-FID之分析条件为注射部温度150℃、管柱温度150℃及侦测器温度200℃,载行气体为一般纯度氮气(99%)。层析管柱为Supel毛细管柱,长度15 ft,内径1/8 in,内膜2.1 mm (Supelco, USA)。固氮活性以μmoles of C2H4formed g-1 dry soil day-1表示之。
    
    可培养性游离固氮菌群的计数、分离与鉴定
    
    为分析可培养性游离固氮菌群受丁基拉草施用的影响,本研究于平面NFB无氮培养基上分离丁基拉草施用第7天与第39天时,控制组与10倍推荐用量(15 g are-1)丁基拉草处理下表观型态相异的菌落,并以NFB培养基加以震荡增殖(10)。以UltraCleanTM Soil DNA Isolation kit (MOBIO Laboratories, Inc.)萃取该土壤微生物的total DNA,以PCR扩增其16 S rDNA片段后以核酸定序仪(ABI PRISMR 3700 DNA Analyzer, Perkin Elmer Applied Biosystems, Wellesley, MA,USA) 侦测该微生物的 16S rDNA 序列。所得序列以 BLAST-N 程 式(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比对GenBank资料库确认其菌属名。
    
    亲缘关系树
    
    前述所得之DNA序列以BioEdit程式(11)进行多重序列比对,并删除相同处理下重复之序列,并保留不同处理下重复之序列。选取BLAST结果中与该DNA序列最相近之一或两组序列,以PhylOgenetic WEb Repeater (POWER, http://power.nhri.org.tw/power/home.htm)(14)绘制亲缘关系图。其方法设定为最大简约性分析法(Heuristic Maximum Parsimony Method)(9),并以靴带式分析法(Bootstrapping Method)(20),重复1,000次确认其分析结果。
    
    结果与讨论
    
    土壤固氮能力之变化
    
    前人研究显示,丁基拉草于砂质壤土中的移动大多停留于表土3 cm以内(5)。因此,本研究将土壤分为上层(0~3 cm)及下层(3~15 cm)分别进行调查。表一为添加15 g are-1的丁基拉草于种植水稻的盆栽中,并于不同水稻生长期采取土壤样品测量其乙炔还原反应的改变,以代表土壤固氮活性的变化情形。结果显示,水稻移植后第7天,施用15 g are-1丁基拉草处理使上层土壤的乙炔还原反应较控制组减低12.6%;但在第37天时则使反应增加23.3%。在水稻开花期(第67天)时,高浓度的丁基拉草施用并无显著影响,然而在成熟期(第100天)时乙炔还原反应则有显著的上升(+7.20%)。这个现象显示上层土壤的游离固氮菌族群可能因丁基拉草的施用而造成菌相长久的变异,并且,也使得土壤固氮作用上升。
    
    于水稻移植后第7天时,施用15 g are-1丁基拉草处理使下层土壤的乙炔还原反应较控制组减低7.5%;但自第37天开始则分别使反应增加41.0%、1.40%及3.40%。这个现象显示下层土壤的游离固氮菌族群可能因丁基拉草的施用而造成菌相长久的变异,并且,于水稻全生长期时皆使得土壤固氮作用上升。
    
    以邓肯氏多变域测验(α=0.05)分析丁基拉草施用(显示栏的变异,以小写字母表示)及不同水稻生长期(显示列的变异,以大写字母表示)所造成的乙炔还原反应变化的显著性。结果显示不同的水稻生育期其土壤固氮作用具有显著的差异,尤其以孕穗期时具有最大的土壤固氮量。丁基拉草施用于孕穗期时亦会造成土壤固氮量的上升,尤其以孕穗期时之下层土壤其增加量最大。
    
    前人的研究结果中显示,丁基拉草的施用可以增进蓝绿菌Anabaena sphaerica的生质量及固氮作用(22)。施用2.9 kg ai ha-1的丁基拉草可提升31.6%游离固氮菌族群的数目,且可提升土壤固氮活性达10% (7)。因此,吾人认为稻田土壤固氮作用的提升可能导因于游离固氮菌总体生质量的提升,或者是游离固氮菌相组成的改变。
    
    可培养性游离固氮菌数量之变异
    
    图二为水稻种植第7天及第39天时,15 g are-1丁基拉草施用对土壤固氮菌数之影响。由图可知,于水稻种植第7天时之上层土壤中(0~3 cm),丁基拉草的施用使固氮菌数目增加了70.6%;但于下层土壤中(3~15 cm),两种处理的族群菌数则无显著的差异。于水稻种植第39天时之上层土壤中(0~3 cm),丁基拉草的施用使固氮细菌数增加了79.3%;于下层土壤中(3~15 cm),丁基拉草的处理使固氮菌的族群数目则增加了60.2%。
    
    结 论
    
    由本研究结果可知,丁基拉草的施用可提升土壤固氮能力,且于水稻生长期间其固氮能力与控制组相较有显著之差异,此差异于水稻孕穗期时更为显著。可培养性固氮细菌数量于水稻孕穗时期有显著的增加,且其族群组成亦有不同,可能为造成土壤固氮能力上升之原因。


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