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   SSR分子标志用于豌豆品种分子鉴定之研究





    
    摘 要
    
    豌豆为国内重要之豆科蔬菜作物,依用途可分为嫩荚用、豆仁用、豆苗用及甜豌豆,本场已育成之品种有龙岩12号至龙岩16号等品种。近年来保护智慧财产权的观念逐渐普及,发展分子鉴定技术以保障作物品种权已成为十分重要的研发工作。本次研究利用77个SSR分子标志,在21个豌豆品种间进行多型性检测,目标为筛选稳定且具有多型性的SSR标志,以作为日后鉴定豌豆品种时的参考依据,本试验测试后共选获17个SSR引子对,这些SSR引子对所产生的对偶基因的数目从2个到9个,平均为4.24个,多型性内含值(PIC)最低为0.2449,最高为0.898,平均值为0.5847。试验结果显示,这17个SSR引子对可作为台湾豌豆品种鉴定的重要依据。
    
    关键字:豌豆、品种鉴定、简单重复序列。
    
    前 言
    
    豌豆(Pisum sativum L.)俗称荷兰豆,是国内重要的豆科蔬菜之一,适合栽培于冷凉干燥气候,在台湾秋冬季节于平地可栽培,春夏季则须要在山区环境才可生产。国内豌豆每年生产面积为775公顷,其中彰化县占了695公顷。豌豆依用途不同,品种可分为嫩荚用、嫩豆用、叶用及甜豌豆等(2,3),近年来本场育成之新品种有龙岩12号、龙岩13号、龙岩14号、龙岩15号及龙岩16号。近年来保护植物品种权的观念逐渐被重视,由于作物品种的研发需要投资大量的时间及人力、物力成本,因此每一个作物品种都是育种研发单位重要的智慧财产。为健全种苗产业之发展,保障育种者之权利,鼓励研发新品种,必须发展可靠的作物品种鉴定技术(1,4,10)。而自交作物或无性繁殖作物之种子、种苗十分容易被复制,其品种权更需要加以保护。作物品种鉴定的传统作法是根据其生理特性或是外观性状特征进行判定,然而种子或种苗本身无法在短时间内测量完整的资讯,例如早熟性、果皮颜色、产量及抗病性等,这些外表型性状在检定过程中亦容易受到栽培环境的影响,而难以客观认定,因此必须藉由DNA检测技术以进行品种鉴定的工作(19)。作物DNA的检测有许多优点,例如可不受作物生育期的限制;可避免环境的干扰;只需少量作物组织(1),因此本次试验期望建立豌品种的DNA鉴定技术。
    
    分子标志(molecular marker)是指作物DNA的特定序列,可经由聚合酵素连锁反应(polymerase chain reaction, PCR)或是限制切割酵素的作用而被侦测(1,20,21)。此技术为作物遗传学及育种学的研究领域提供了非常实用的工具,可应用在品种鉴定、亲缘分析与辅助育种。目前最广泛应用的分子标志为简单重复序列(simple sequence repeat, SSR),SSR是指作物DNA序列中以1个到6个碱基为单位重复排列而成的序列,这些序列的重复次数在各品种间有差异,经PCR增幅后的产物具有长度多型性,因此可作为品种鉴定的依据,目前已广泛应用在各种作物的育种学试验(6,8,11,14,15,17)。在豌豆的SSR试验方面,Burstin等在2001年利用网路资料库搜集了663个豌豆的SSR序列,并且设计引子测试多型性,最后筛选得到31个多型性SSR标志(7)。 Loridon等在2005年发表了豌豆的SSR遗传图谱,在此图谱中共包含了239个豌豆SSR标志,分布于整个基因组,在此遗传图谱中有85%的SSR区间小于10 cM。本次研究即是采用Loridon等发表的图谱所提供的SSR引子进行测试(14)。本次研究之目的是利用文献中的SSR引子序列检测国内21个栽培品种,借此筛选表现稳定的SSR标志作为未来品种鉴定之依据。另一方面,本次试验中累积的多型性SSR标志亦可作为分子标志辅助选种的工具,以提供未来育种者参考。
    
    材料与方法
    
    试验材料
    
    本次试验共采用21个豌豆品种,包括豌豆龙岩11号、龙岩12号、龙岩13号、龙岩14号、龙岩15号、龙岩16号、三十日、白仁、法国大荚、黑鼻豌豆、日本矮性黑目、在来白花、新黑目、乙女、红花软荚、萨摩、软荚ML、泰国红花、泰国白花、翠绿甜豌豆303号及黑目,其中龙岩11号至龙岩16号种原由本场蔬菜研究室提供,其余品种由农业试验所国家作物种原中心提供。豌豆种原栽培后,摘取嫩叶秤取0.1 g萃取其DNA。
    
    DNA萃取及聚合酵素连锁反应
    
    萃取核酸采用的试剂为TANBead Plant DNA Auto Plate (台湾圆点奈米技术股份有限公司,台湾),将叶片组织置于1.5 mL离心管,浸泡于液态氮,以钢珠振荡磨碎之后按照产品操作手册之步骤进行核酸萃取,已萃取之核酸保存于-20 ℃冰箱备用。聚合酵素连锁反应(PCR)使用的试剂为Fast-Run Taq Master Kit (波仕特生物科技股份有限公司,台湾),总反应体积为25 μL,内含10 mM Tris-HCl、50 mM KCl、0.01% Gelatin、1.5 mM MgCl2、0.1% Triton X-100、3.75 U Taq DNA polymerase、1 μL DNA及0.4 μM 引子。核酸引子序列如表一所示,核酸引子皆委托源资生物科技公司合成(源资国际生物科技股份有限公司,台湾),反应仪器为GeneAmpPCR System 9700 (Applied Biosystems, USA),PCR反应条件为94℃ 3分钟,接着循环33次94℃30秒、50℃ 30秒、72℃ 60秒。最后是72℃ 5分钟。反应温度依各分子标志之不同而调整。 PCR产物以3%高解析度琼脂胶MetaPhor agarose (LONZA, Rockland, USA)进行电泳分离。 
    
    SSR引子多型性测试
    
    SSR分子标志的引子序列主要来自国外学者发表之豌豆基因图谱(14),总共下载78组引子序列,PCR产物以琼脂胶进行电泳分离,如果品种间SSR片段之长度太过接近导致难以判定者,则使用毛细管电泳进行分析,毛细管电泳之分析委托源资公司(源资国际生物科技股份有限公司,台湾)与基龙米克斯公司(基龙米克斯生物科技股份有限公司,台湾)进行,使用的仪器为ABI 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA)。单一组SSR引子测得不同品种间多型性机率以PIC (polymorphism information content)值表示,PIC值越大则代表易筛选得到品种间之多型性。 
    
    品种鉴定流程之建立
    
    经多型性试验后筛选的SSR分子标志,根据各个对偶基因的核酸片段长度大小进行分型,并采用大写英文字母进行编码,编码的结果即可整理成品种对照表并设计成品种鉴定流程图。
    
    结 果
    
    一、SSR分子标志之多型性测试结果
    
    在本次试验中测试的77个SSR标志中,共有39个有多型性,占全部的50.65%,依照多型性测试的结果,共选择其中17组引子可产生再现性高且容易判别的SSR标志作为品种鉴定的依据,分别是AA238、AA446、AB31、AB33、AB40、AA321、A9、AB133、AC58、AD73、AD83、AD147、AD270、D21、D23、PSADH1以及P1109。这17组引子所产生的多型性分子标志测试结果如图一及表二所示,各组引子所产生之对偶基因分子标志的数目从2个到9个,平均为4.24个。 PIC值最小者为AA321,仅有2个对偶基因座,其PIC为0.2449,PIC值最大者为AD270,有9个对偶基因座,其PIC为0.898,平均PIC值为0.5847。图一为SSR引子AC58的PCR产物经琼脂胶电泳分析后的结果,以AC58为例,许多品种在同一基因座具有明显可辨别的PCR产物,而核酸片段大小则有差异,在200到250 bp的范围间表现丰富的多型性。
    
    二、各品种之编码结果
    
    在本次试验中测试的21个品种经17组SSR引子增幅后,各自产生的基因座分型如表三所示。表中每一个品种都有特定的17个代码,故皆可被独立鉴定,显示这17个SSR可作为品种鉴定的依据。从各品种的代码可约略看出相似性高低,例如龙岩14号(Taichung 14)与萨摩(Satsuma)在14组SSR引子产物仅2个(AB33和AD73)有差异,其原因为萨摩为龙岩14号的母本。而翠绿甜豌豆303号和龙岩13号只有2个差异的SSR基因座(AC58和AD147),其园艺性状68 龙岩区农业改良场研究汇报第一一五期皆为甜豌豆,因此亲缘关系较为接近。而亲缘关系最为接近者是黑鼻豌豆(HPWT)与日本矮性黑目(Japan AHHM),在17个SSR基因座仅有一个差异性的SSR基因座,虽品种名称看不出关联性,但本次试验结果显示此2个品种遗传相似度十分接近。
    
    三、品种鉴定图
    
    在本次试验的目标品种(龙岩11号至龙岩16号)中,每一个品种都只需要2个到3个SSR标志即可独立鉴别,为达成鉴定6个目标品种的目的,经过筛选之后选定4组引子对产生的分子标志建立品种鉴定图,这4组引子对分别是AA446,AB33,AD270及AD73,如图二所示。本鉴定图是以这21个品种的基础建立的,未来如有更多新品种拟加入本鉴定图,亦可开发更多适合鉴别的SSR,将此鉴定图继续扩大延伸。
    
    讨 论
    
    我国作物分子标志之研究方向较多集中在水稻与蝴蝶兰(4,10,12),较少研究论文为针对SSR标志在豆类蔬菜之应用,本篇报告所筛选的17个SSR分子标志可作为未来豌豆品种鉴定及辅助育种之参考。豌豆为自交作物,种子复制容易,因此品种保护的工作显得格外重要,而本SSR 分子标志用于豌豆品种分子鉴定之研究71篇报告所发展的SSR品种鉴定技术,未来可适时提供客观且明确之证据,避免侵权行为之发生。以下仅就试验过程中发现的现象进行讨论。
    
    表二中PIC值的高低大致上与对偶基因座的数目成正比,但有三个例外,分别是D23、AA446以及AB31。 D23虽然有3种对偶基因座,但绝大多数为B型,因此测验所得的多型性较一些只有两种对偶基因座的SSR为低。而AA446则是因为A、B、C、D等4种型的对偶基因座分配平均,所以PIC高过具有7种型的PSADH1,同样的情况也发生在具有7种型的AB31,其PIC高过具有8种型的AD78和AC58。从PIC值的计算公式中可以发现其大小不仅与对偶基因座的数目有关,也与各对偶基因在品种间的所占比例有关(5),当各型比例越接近均等则PIC值越大,相反的,若是有其中有一个对偶基因座所占比例接近1,则PIC值会越接近于0。表三中各豌豆品种亲缘关系最为接近的两个品种是黑鼻豌豆(HPWT) 与日本矮性黑目(Japan AHHM),从两者的品种名称无法判断来自同一系统。地方品种的命名通常都以明显的性状作为依据,像是红花、白花、黑鼻、黑目及软荚…等,都是常用的词汇,名称经常会重复。而黑鼻和黑目所描述的其实都是黑色的种脐,某些品种可能只是国、台语的发音不同就被标记为不同品种。因此育种学家收集种原时,若能以SSR分子标志加以评估,即可避免传统命名的混淆,容易找出脉络。分子标志的应用不仅可以辅助种原的保存管理,在选定杂交亲本时更可提供有力的资讯,使育种学家得以选择遗传歧异度较大的品种进行杂交,后裔族群分离的效果才会明显。
    
    传统对于品种的描述是依据各种外表型态,描述的过程必须以一个已知的品种作为对照,而后进行各种测定,以建立品种的构成要件:包括可区分性(distinctness)、均一性(uniformity)以及稳定性(stability)。传统的测定过程须耗费大量的时间、金钱与人力成本,并且容易受到外在环境的影响。随着分子标志技术的演进,国际植物新品种保护联盟(UPOV)的生化及分子技术小组认可SSR标志作为品种的特征,但必须符合两个前题:(1)分子的模式与外表特征是相关的;(2)作为可区分性的标志要有均一性及稳定性(4,19)。针对第一点笔者认为新品种特定性状基因与SSR遗传距离愈接近愈理想,理论上可达成。而针对第二点则须注意采用重复性高且易于判读的分子标志。在可以预见的将来,分子标志将会成为新品种检定的主要工具之一,而各项作物品种分子鉴定的技术也将会越来越普及。sadf近年来分子标志技术也逐渐被应用在各种作物的辅助育种试验,包括水稻的抗白叶枯病(9)及耐淹水性状(22)、小麦抗穗上发芽性状(8)、萝卜的雄不稔性(16)以及梨的乙烯合成基因标志(13)。这些分子标志可节省传统育种所需的时间、人力及物力,大量增进育种效率,分子标志辅助育种技术是未来作物育种改良的趋势,因此国内作物育种单为亟需发展各项作物的分子标志技术。豌豆的外表型性状十分多样化,是具有高度利用潜力的蔬菜作物,其育种试验也显得格外重要。另一方面,豌豆抗病品种之育成对国内产业有很大帮助,未来可透过分子标志的辅助来达成(18)。豌豆有几项特点使其容易导入分子标志辅助育种(MAS)技术:一、豌豆的遗传行为相对单纯,基因组由7对染色体组成(2n = 2X = 14),为同质结合,容易进行基因定位。二、豌豆之基因组已有学者发表数百个SSR标志,并已绘制遗传图谱,研究资源丰富。


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