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   菩提奇异球菌(Deinococcus ficus) CC-ZG207之羽毛分解液作为速效性液肥之研究





    摘 要
    
    羽毛为家禽类大宗之废弃物。羽毛系由羽毛角蛋白质组成,由于角蛋白质之结构紧密及双硫键含量丰富,因此不易分解。羽毛可作为土壤有机肥质料供作物养分吸收,然因羽毛分解速率缓慢,而无法立即提供作物生长初期养分吸收,若以微生物初步分解羽毛则可提高其养分释放率。本研究以菩提奇异球菌(Deinococcus ficus)菌株CC-ZG207进行羽毛分解,发现以羽毛作为唯一碳氮源之培养基中,其角蛋白酶活性于培养的第4天达到最大为21.9 U/mL,羽毛分解率于培养的第2天至第8天,由64.8%增加至79.4%。菩提奇异球菌菌株CC-ZG207之羽毛分解液含有多种游离胺基酸,其中包含许多必需胺基酸,且胺基酸的含量以methionine 含硫必需胺基酸为最多。本研究另分析羽毛分解后之培养液之EC、可溶性铵态氮、可溶性磷及可溶性钾之含量分析,其结果显示菩提奇异球菌菌株CC-ZG207分解羽毛后培养液之电导度值、可溶性铵态氮、可溶性磷及可溶性钾较对照组皆明显增加。本研究结果显示菩提奇异球菌菌株CC-ZG207之羽毛分解液具有作为农业废弃物开发应用的潜力,可应用于动物饲料添加或作为液态有机质肥料,且可加速羽毛废弃物再利用之效率。
    
    关键字:菩提奇异球菌、羽毛分解、游离胺基酸。
    
    前 言
    
    羽毛由角蛋白质组成常做为农业废弃物再利用,如动物饲料添加或土壤肥料施用(8)。羽毛为缓慢释放之有机质(9),以羽毛做为动物养分添加时常须以高温高压处理以破坏羽毛结构,并使其释放出胺基酸以作为动物之营养所需,然而高温高压处理法常导致某些胺基酸之破坏,如methionine、lysine及tryptophan,而减少其营养价值(20),若以微生物分解羽毛则可以保留较高的营养价值(17)。羽毛作为植物养分来源时,常会有养分释放缓慢的问题,使植物生长初期生长缓慢,因此若要以羽毛做为植物生长初期之养分而避免植物生长缓慢之问题,则可以微生物分解羽毛后之产物做为土壤肥料之施用,应可提高养分释放率,并克服植物初期生长缓慢之问题。因此本研究评估以菩提奇异球菌分解羽毛后之产物成分分析,以明了其分解产物的特性及应用至农业领域之价值如动物饲料添加及土壤肥料应用。本研究之菩提奇异球菌(Deinococcus ficus)菌株CC-ZG207取自中兴大学土壤环境科学系杨秋忠教授所筛选之新颖菌种(22),选取此菌种之原因为此菌种之基因组解码资讯中具有许多蛋白质分解酵素之基因,因此菩提奇异球菌先天上具有分解含氮有机物之潜力,但目前尚未有羽毛分解之研究。
    
    材料与方法
    
    微生物之培养条件
    
    本研究培养菩提奇异球菌于50 mL之含羽毛液态培养基中,羽毛培养基为基本矿物盐加0.75% (w/v)鸡羽毛,基本矿物盐配方参照前人研究(4),并修改为每升蒸馏水中添加1 g KH2PO4,1 g K2HPO4, 0.2 g MgSO4及0.02 g CaCl2。本研究以1 M氢氧化钠调整羽毛培养基至pH 9并于37℃下、150 rpm的环境中震荡培养。
    
    羽毛分解率测定
    
    本研究首先培养菩提奇异球菌CC-ZG207于5 mL液态肉汁培养基(Himedia, India)中,于30℃培养至对数生长期,以无菌水调整OD600至0.9后,取50 μL至50 mL之含羽毛液态培养基中,于37℃ 150 rpm培养2~8天,将培养液倒入已于70℃烘干之滤纸中(Sartorius-stedim 392,台湾莎多利斯有限公司),待滤液完全下渗后,收集滤纸并置于70℃烘箱中去除水分至恒重后,秤取残留羽毛之重量。本研究肉汁培养基灭菌条件为121 ,℃1.05 kg/cm2,灭菌30分钟而羽毛培养基则以相同条件灭菌15分钟。羽毛分解率(%)=(羽毛原干重-残留羽毛干重)×100 羽毛原干重
    
    角蛋白酶活性分析
    
    本研究之可溶性角蛋白质萃取方法参照前人研究(21),以其萃取之角蛋白质为角蛋白酶活性分析之基质,进行角蛋白酶之活性测试(7,角蛋白酶活性测定依此公式计算, )U= 4 × n × A280/(0.01×10),4是最终反应体积(mL)、n是稀释倍数、10是反应时间(min)而A280是吸光值(5)。
    
    菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛后之培养液之样品收集
    
    本研究分析菩提奇异球菌菌株CC-ZG207培养于37℃之羽毛培养基中之第2天及第6天的培养液之上清液的pH、电导度值(EC)、可溶性铵态氮、磷、钾、游离胺基酸之分析。培养液之上清液为培养液以8,000 xg离心10分钟后,将上清液以0.45 μm滤膜过滤后之液体。本研究另将未接菌之羽毛培养基于150 rpm震荡15分钟后以8,000 xg离心10分钟后,将上清液以0.45μm滤膜过滤后之液体作为空白组实验(Blank)。本研究将未接菌之羽毛培养基以高温高压灭菌15分钟后,以8,000 xg离心10分钟,将上清液以0.45 μm滤膜过滤后之液体作为灭菌空白组(Blank-S)。菩提奇异球菌(Deinococcus ficus)CC-ZG207 之羽毛分解液作为速效性液肥之研究55
    
    培养液pH值、电导度值(EC)之测定
    
    本研究欲了解菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛后之培养液之pH值及电导度值,以做为未来植物养分添加时的应用参数,本研究之pH值及电导度值的测定以pH计及电导度计测定。
    
    培养液之可溶性铵态氮浓度分析
    
    本研究欲了解菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛后之培养液之可溶性铵态氮的含量以做为未来植物养分添加时的应用参数。本研究以靛酚比色法分析铵态氮的浓度(3)。
    
    培养液之可溶性磷浓度分析
    
    本研究欲了解菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛后之培养液之可溶性磷的含量以做为未来植物养分添加时的应用参数。本研究以钼黄法分析菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛后之培养液之可溶性磷的含量,分析方法参照微生物肥料检验法中的溶磷菌之溶磷活性分析(1)。
    
    培养液之可溶性钾浓度分析
    
    本研究欲了解菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛后之培养液之可溶性钾的含量以做为未来植物养分添加时的应用参数。本研究以火焰光度计分析菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛后之培养液之可溶性钾的含量,分析方法参照微生物肥料检验法中的溶钾菌之溶钾活性分析(2)。
    
    培养液之游离胺基酸分析
    
    本研究欲明了菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛后之培养液之游离胺基酸种类及含量分析,除论证羽毛分解之证据并可由胺基酸种类之分析以了解其分解之特性,本研究委由嘉义大学检验分析及技术推广服务中心进行分析。
    
    结果与讨论
    
    羽毛分解率及角蛋白质活性分析
    
    本研究发现菩提奇异球菌CC-ZG207培养于37℃之羽毛培养基(pH 9,羽毛0.75%)中,培养至第2天便有明显的羽毛分解,使其成为水溶液态(图一)。菩提奇异球菌CC-ZG207之羽毛分解率于培养的第2天为64.8%、第4天为71.4%、第6天为78%而第8天为79.4% (图二)。本研究结果显示菩提奇异球菌CC-ZG207培养至第6天的羽毛分解效能已达到最大值,培养至第6至第8天其羽毛分解效能已明显下降(羽毛分解率仅增加了1.4%) (图二)。菩提奇异球菌CC-ZG207于羽毛培养基培养至第2天,其羽毛分解率为64.8%,相较于前人研究提及的Elizabethkingiameningoseptica KB042(14)及Streptomyces exfoliatus CFS 1068(10)于羽毛培养基培养至第二天的羽毛分解率分别为45%及28%,其结果初步推论菩提奇异球菌CC-ZG207在生长初期(第2天)具有高的羽毛分解效率。菩提奇异球菌CC-ZG207之角蛋白酶活性分析,其结果显示于培养的第2天至第8天其角蛋白酶的活性增加,且于培养的第4天可达最大的酵素活性值约21.9 U/mL (图二),显示菩提奇异球菌CC-ZG207以角蛋白酶分解羽毛之证据。本研究发现菩提奇异球菌CC-ZG207于培养的第2天具有较高的羽毛分解率,然而其角蛋白酶活性却在培养的第4天达到56 龙岩区农业改良场研究汇报第一一五期最大,推测可能由于培养至第4天时,因较难分解之角蛋白质存在量相对较多,因而促使菩提奇异球菌CC-ZG207之羽毛分解相关之基因表现量提高,并导致角蛋白酶之数量增加后,显现于培养的第4天其角蛋白酶活性明显增加。本研究结果显示未来应用菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛可于培养的第二天之羽毛分解液作为农业领域之应用如动物饲料添加或相对速效性之肥料。
    
    本研究欲明了菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛的第2天(代号D2)及第6天(代号D6),其培养液之pH值、电导度值(EC)、铵态氮、可溶性磷及可溶性钾的含量,以作为施用至植物做为养分添加时的应用参数。本研究中未接菌之羽毛培养基(pH 9,0.75%羽毛)的上清液之代号为Blank而将未接菌之羽毛培养基灭菌15分钟后的上清液代号为Blank-S。结果如表一所示,本研究之羽毛培养基中因为没有添加铵离子作为细菌生长之氮源,因此培养基中的铵态氮含量并不高(Blank,1.4 mg/L,表一),而经由高温高压灭菌过程中,会破坏部分羽毛之结构而溶出铵态氮,因此灭完菌后的羽毛培养基之铵态氮含量约为没有灭菌的4倍,其浓度约为5.6mg/L (表一)。
    
    本研究由表一中可发现随着菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛的时间增加,其EC值也跟着上升,显示分解羽毛过程中,从羽毛所释出的离子也随着增加,若与没有接菌之羽毛培养基(Blank)及灭过菌的羽毛培养基(Blank-S)相比,则菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛后之培养液的铵态氮、可溶性磷及可溶性钾的含量皆增加,由于菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛后将释出铵离子做为氮源之利用,因此可以发现相较于没有接菌之羽毛培养基(Blank及Blank-S)。
    
    本研究比较菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛的第2天(D2)及第6天(D6)的培养液之铵态氮、可溶性磷及可溶性钾的含量变化,表一中显示菩提奇异球菌CC-ZG207培养于羽毛培养基的第2天(D2)到第6天(D6),其铵态氮含量减少、可溶性钾的增加量较多,而可溶性磷在菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛的第2天及第6天差别不大,其中分解羽毛的第2天其铵态氮含量较分解羽毛的第6天为高,其可能原因为,菩提奇异球菌CC-ZG207生长时需要氮源的吸收,因此分解羽毛作为氮源利用,而在生长初期,羽毛中较易被分解之角蛋白质(如结构较松散之角蛋白质)先被分解,因此释出较大量的铵态氮作为菩提奇异球菌CC-ZG207的养分吸收并进行细胞繁殖,随着培养天数的增加,细菌数量也跟着增加,加上较难分解之羽毛结构所释出的铵态氮含量较低,因此菩提奇异球菌CC-ZG207培养于羽毛培养基的第6天其培养液的铵态58 龙岩区农业改良场研究汇报第一一五期氮含量较培养的第2天为低。本研究显示菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛后将释放许多养分,包含可溶性之氮、磷、钾,然而本实验中分解羽毛后的可溶性铵态氮含量却不是可溶性氮、磷、钾含量中最多的,推测可能原因为分解羽毛之培养液中仍含有多量的胜肽及胺基酸,而这些胜肽及胺基酸相较于羽毛而言更容易分解,因此菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛之培养液中的铵态氮含量虽没有可溶性磷及钾多,但却含有较多容易分解及利用的有机态氮(如胜肽及胺基酸),有利于生物分解后所释出的离子态氮供植物吸收利用。
    
    菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛后之培养液之游离胺基酸分析
    
    本研究发现菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛的2天后释出许多种类之游离胺基酸(表二),其中含有必需胺基酸的含量由多而少分别为methionine、arginine、phenylalanine、valine、threonine、leucine、isoleucine及lysine而菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛至第6天其培养液中的必需胺基酸含量由多而少分别为methionine、phenylalanine、lysine、arginine、leucine、threonine及isoleucine。菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛的第2天其胺基酸的释出总量较第6天为高,且大部分种类的胺基酸含量都减少,含量增加的胺基酸有aspartic acid (增加0.08μg/mL)、cysteine (增加4.44 μg/mL)、methionine (增加16.19 μg/mL)、phenylalanine (增加11.18μg/mL)及lysine (增加0.82 μg/mL)。羽毛角蛋白质的双硫键含量多且结构完整,因此羽毛不易分解,菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛的第6天其cystein的含量增加,cysteine为组成双硫共价键之胺基酸,推测角蛋白质中有许多双硫键被破坏,羽毛分解的程度增加。前人研究显示,Streptomyces sp. MS-2分解羽毛至第3天进行培养液之游离胺基酸含量分析,其含量最多的胺基酸分别为valine、isoleucine、alanine及phenylalanine(12,)Bacillus altitudinisGVC11分解羽毛至第3天的培养液之游离胺基酸含量以tyrosine、phenylalanine、glycine及valine的含量最多(11),Fervidobacterium islandicum AW-1分解羽毛1天后,其培养液之游离胺基酸含量以alanine、proline、valine及tryptophan含量最多(15),而Meiothermus ruber H328分解羽毛至第6天其培养液之游离胺基酸含量以glycine、serine、valine、leucine、alanine及isoleucine含量为最多(13),以上结果显示细菌分解羽毛后常释出大量的胺基酸valine、alanine及phenylalanine等,但含硫胺基酸(如methionine及cysteine)之含量并不多。前人研究指出羽毛中methionine含量并不丰富(6),然而菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛后所释出的胺基酸却以methionine为最多且分解至第6天其含量依然增加,因此菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛后能释出相对多量的必需胺基酸methionine,是其分解羽毛后养分释放上的特殊之处,前人在饲料配方研究上提及含硫胺基酸如cysteine及methionine对动物生长而言是十分重要的营养源(18,19,23),本研究发现菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛后能释出相对多量的含硫胺基酸methionine及cysteine,因此菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛后之产物推论具有应用至动物饲料添加上的价值。由于羽毛不易分解的特性,将羽毛施用至土壤做为植物养分之吸收,其缓慢分解的特性将无法立即供应植物养份之吸收。前人研究指出植物具有吸收胺基酸之能力(16),且胺基酸较角蛋白质易分解而转化成无基态氮,因此本研究以菩提奇异球菌CC-ZG207分解羽毛所释出之胺基酸,推论具有相对快速补充植物所需养分之效益。菩提奇异球菌(Deinococcus ficus)CC-ZG207 之羽毛分解液作为速效性液肥之研究59
    
    结 论
    
    本研究结果显示以菩提奇异球菌分解羽毛后,可于分解的第二天释出相对多量的游离胺基酸及可溶性氨态氮,且养液中的可溶性磷及钾也有明显的增加,显示羽毛分解的证据而羽毛分解后含有的胜肽、胺基酸及可溶性氮为较角蛋白质容易分解的营养源,可做为相对速效性肥料之应用,分解羽毛六天因培养液含有较多含硫胺基酸可作为饲料添加使用。本研究结果显示以菩提奇异球菌分解羽毛可应用于农业领域且可加速羽毛废弃物再利用之效率。


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