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   朝天椒大孢子发育与子房组织化学特征的探讨





    摘 要
    
    朝天椒(Capsicum annuum var. conoides)为番椒育种重要之耐热、抗病毒种原,本研究就朝天椒不同生长期的花蕾,依据其纵径大小与外观型态将花蕾分为七期,进行解剖与埋蜡切片观察记录,调查大孢子分化发育情形与探讨组织化学特征。花蕾第一期花器已经大致发育完成,此期蕾柱伸长,胚珠原陆续形成;第二期时花瓣可见但包覆于花萼内;第三期花瓣略为突出花萼,在胎座同一切面上排列12到15个胚珠已形成大孢子;第四期为花器完成期,花瓣已突出花萼达1/3;第五期开花初期,花瓣突出花萼超过1/2。第六期为开花中期,雄蕊逐渐开裂,花瓣外露部分达花萼两倍,第七期为花瓣完全开放,授粉完成。组织化学染色分析显示,在第五期时,胚胎基部与胎座间有明显的油滴形成,多糖体主要分布在子房壁内侧,蛋白质则存在于胚与维管束,结晶沙则随着花蕾发育逐渐堆积在维管束周遭。
    
    关键字:番椒、胚珠、油胞。
    
    前 言番椒(Capsicum annuum L.)属于茄科(Solanaceae)、番椒(Capsicum)属草本作物,原产地为新大陆热带与亚热带地区。哥伦布发现新大陆后于1493年首度传到西班牙,于15世纪推广至全欧洲,17世纪传到中国,但另一途径于16世纪时已传到日本(1,2,12)。番椒植株高度为1~3 m,不耐霜雪,于温带地区属一年生作物,而热带地区虽可行多年栽培,不过由于经济产能考量,多数经济生产仍以一年栽培为主。
    
    番椒依其是否具辛辣味,可分成甜椒(bell pepper, sweet pepper)及辣椒(hot pepper, chilipepper)。辣椒的辛辣味主要来自于辣椒素(Capsaicin, C9H12O2),具辣味品种的胎座及其附近表皮细胞中含有油腺细胞(oil cell)可制造此辣椒素(6,12,15,16),但种子并不具有此物质,具辛辣味者,为有少量胎座附着的原故(17,20)。辣椒果实中辣椒素的含量随品种、品系、栽培地域、季节及采收成熟度而异(13)。虽然辣椒只作为调味佐料之用,在蔬菜重要性不及同科的番茄,但不论在热带、亚热带、温带地区,辣椒均不失为重要的经济作物。根据FAO(13)的介绍,其干物平均营养价值(AVI average nutritive value)高达80.7,为番茄的两倍多,而鲜重的AVI值则为番茄的11.7倍(3,13),尤其富含vitamin A和C,因此栽培面积及其产量都有逐年增加的趋势(5)。
    
    辣椒的辣椒素(Capsaicin)也深受重视,其芬芳的辛辣味有促进食欲、帮助消化之用(16),在医学领域也发现辣椒素可以抑制部分癌症细胞、具有抗氧化、抗关节炎、止痛功效,并可刺激肠胃道黏膜,减少肠胃道癌症发生机率(17)。
    
    番椒花序单生,具有雄蕊和雌蕊两性器官的两性花(hermaphrodite flower),雌雄同株,通常有五枚萼片和五枚花瓣,罕有六、七枚,着生叶腋。甜椒花蕾长约0.7~0.8 cm,横径0.7 cm左右;而辣椒花较小,长0.6 cm左右,横径0.5~0.7 cm,花冠多为白色,也有少数品种为绿白色或淡黄色(8)。雄蕊花药5枚成一轮,围绕着雌蕊,雄蕊具有短花丝和较长的花药,药隔狭长,两边各具有两个花粉囊。子房下位,具有二心皮,属中轴胎座,每一心皮具有多个直立胚珠,其花期为四到五月之间,为自花授粉作物,其自然杂交率,依据报告可达9~32% (1,4,5,18)。
    
    开花植物器官分化发育的过程一般为向顶顺序(acropetal),亦即依花萼、花瓣、雄花器、随后雌花器的顺序,向心地逐渐从位于外侧的器官顺次向内侧器官分化发育。若从更微观的花芽分化过程探讨,则可观察到花器通常由芽体中央肥厚隆起的花原基的周围开始发育,从最外侧的萼片原隆起,在萼片隆起的过程中,在萼片内侧花瓣原突起,随后在花瓣突起处的内侧出现雄蕊原突起,接着在雄蕊原内侧雌蕊原隆起。这时萼片变大,将其余的花器包被起来,其后在雄蕊花药中形成花粉,在雌蕊的子房中形成胚囊(9,11,14)。
    
    番椒的始花节位早熟品种在主茎的6~7节,晚熟品种在14~18节,少数品种在20~22节才始花;其开花顺序是由下至上陆续开放,在正常栽培条件下,下层花开放后4~5天,上层花即开放,若过早进行杂交,会使植株提前由营养生长转向生殖生长,影响植株生长势及后期着果,从而降低了种子产量及果粒重,所以应将第一花序去除(3,5,8,10)。成熟的花朵在晴天,一般在早晨6~8时左右花瓣逐渐绽放张开,如逢阴天则开放较迟,随着花的张开,花药也逐渐裂开,在8~10时左右花粉散出,在气温过低或不良环境条件下,花药往往会在花蕾内提前开裂。在自然条件下,以自花授粉为主,风力传粉范围在1 m左右。番椒的花为两性花,授粉后花粉会在柱头上萌发,形成花粉管,雄配子通过花粉管进入子房完成其受精过程(1,18)。
    
    番椒喜温暖干燥气候,种子发芽适温在25~30℃之间,植株发育适温在25℃左右,温度高时不易受精结果,温度低时生长缓慢而不旺盛,果实变型,开花时温度在10~15℃时,纵使能结果,种子常会败育。
    
    本研究所使用之材料属于直立椒或簇生椒类(C. annuum var. fasciculatum Bailey),其叶片狭长,果实簇生向上生长、果色深红,果肉薄,辣味什强,油分高,晚熟,耐热,抗病毒力强,多作干辣椒栽培。本研究主要目的为探讨朝天椒胚囊发育过程,同时探讨子房发育早期组织化学的特征,并和甜椒果实比较,希望能了解不同发育时期子房内油腺细胞与辣油分布的情形,以作为育种参考。
    
    材料与方法
    
    试验材料
    
    本研究的试验材料为亚蔬中心所提供之朝天椒(Capsicum annuum var. conoides)及甜椒(Capsicum annuum var. annuum),花蕾材料均采收于亚洲蔬菜研究发展中心,依据其大小与外观型态,将花蕾生长依其纵径大小分为七期,拍照后,固定于FAA (福马林:冰醋酸:50%酒精)溶液中带回实验室,再分别就以下方法进行切片观察与纪录。
    
    试验方法
    
    一、埋蜡切片法
    
    
    大小不同时期的花蕾,以FAA固定后,经TBA系列脱水、渗蜡,再以石蜡包埋,将修整后的蜡块放上转动式切片机切成11 μm,再以蛋白黏着剂贴附于载玻片上,在40℃的热板上使其平展并黏附于载玻片上,再以二甲苯溶蜡、酒精系列复水,进行safranin和fast green双重染色、二甲苯脱水,最后以巴尔森液进行封片,烘干,并于显微镜下观察(7)。
    
    二、组织化学检定
    
    (一)脂质检测
    
    埋蜡切片以二甲苯溶蜡后,复水至70%酒精中,再以新鲜苏丹黑B (Sudan Black B)溶于70%酒精中,在30~60℃下处理60分钟,再以70%酒精浸泡数分钟,再以蒸馏水冲洗,滴甘油后封片观察,脂质会呈黑色反应。
    
    (二)多糖体检测
    
    埋蜡切片以二甲苯溶蜡后,复水至50%酒精中,先以0.4%高碘酸溶液(periodic acidsolution, PAS)在56℃下处理30分钟,以蒸馏水冲洗三次,浸于希佛氏液(Schiff"s reagent),再于温室下处理15分钟,以0.5%亚硫酸氢钠(NaHSO4)处理2分钟,最后以蒸馏水冲洗后,再以甘油与水1:1盖上玻片封片,以显微镜下观察,多糖类会呈现粉红色。
    
    (三)蛋白质检测
    
    埋蜡切片以二甲苯溶蜡后,复水至50%酒精中,以7%醋酸(acetic acid)浸泡2分钟,再以考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue)溶于7%醋酸中,以60℃处理20分钟,再浸泡于0.1%醋酸中,最后以蒸馏水冲洗后,再以甘油与水1:1盖上玻片封片,以显微镜下观察,蛋白质呈蓝色。
    
    结果与讨论
    
    一、花蕾型态及不同分期观察
    
    朝天椒花朵最外围是五枚花萼,平滑无齿状缘呈绿色;在内侧的五枚花瓣呈白色与花萼互生排列生长。本研究参考Novak (18)对番椒植株花蕾发育外观与小孢子发展之阶段关系进行区分,将朝天椒与甜椒花蕾生长依其纵径大小分为七期,针对不同时期的发育之花蕾进行观察与纪录。本研究之分类依据其大小与外观形态分述如下(图一):第一期:纵径3 mm以下,花萼尚未开裂且看不见花瓣。第二期:纵径约3~4 mm,花萼内侧隐约可看见深绿色花瓣生成。第三期:纵径约5 mm,花萼已开裂,花瓣呈绿色,完整圆弧型,刚凸出花萼。第四期:纵径约6~8 mm,花瓣呈绿色且已完全凸出花萼2 mm。第五期:纵径约9~10 mm,花瓣变薄转为白绿色,且已有膨胀现象。第六期:纵径约10~12 mm,花瓣变为白色,此时为花朵开放前1~2天。第七期:纵径约12~15 mm,花瓣开放,雄蕊花药开裂。
    
    朝天椒的花从第一期到第七期开花,约经历7~10天可完成,视温度而定。开花开始后 (图一-A6)在室温下经过一到两天,萼片和花瓣都会同时完全向外张开(图一-A7)。朝天椒具雄蕊四枚,每个雄蕊的花丝上带有一枚花药,紧密的围住蕾柱和柱头,开花时花药开裂,同时花柱伸长。由于花柱向上延伸时,柱头与花药的内面接触。这样的过程使大量花粉容易附着于柱头上,便于进行授粉的动作,因此辣椒常常靠自花授粉的方式受精,而不需借助于昆虫或其他外力来行花粉授精。
    
    二、各时期花蕾内部解剖观察
    
    由花蕾发育的第一期到第七期,纵径亦从小于3 mm成长到15 mm,为了比较不同时期花蕾的内部发育情形,因此组合各阶段的解剖切片(图一B、C),以对各阶段的发育特征有较全面性的认识。针对各阶段雌配子体的发育情形,则另以切片图作更深入的解剖特征探讨(图二)。图二、朝天椒大孢子分化发育特征。 A、第一期时胚珠原从胎座边缘隆起。 B、第三期形成大孢子母细胞。 C、第四期时大孢子母细胞开始分裂形成两个细胞。 D、第四期之胚基部有一群细胞质浓厚多边型细胞,推测为油细胞。 E、F、第五、六期时,胚囊已大致形成。 
    
    由各个时期的纵切面来看,第一期的子房大小约0.3 mm × 0.5 mm (图一-B1),花柱高度略低于花药,且花药尚未成熟,柱头亦未受粉,由子房纵面解剖可观察到8个胚珠原(ovuleprimordium)形成,陆续突出于胎座表面(图一-C1)。第二期时,已经可观察到花瓣但其尚未突出花萼(图一-B2),子房大小约为0.4 mm × 0.5 mm,花柱高度约等高于花药,此时期,小孢子母细胞已分裂产生四分子体(tetrad,图一-C2)。第三期的子房大小约为0.9 mm × 1.1 mm,花柱长约0.6 mm (图一-B3),花粉囊尚未成熟呈乳黄色,柱头尚未有授粉反应,胚珠中心为大孢子母细胞(megaspore mother cell)被珠被包覆(图一-C3),而珠被会形成未来的种皮(seedcoat)。第四期的子房明显拉长到约1.5 mm,长宽比约2:1,胚珠基部分化出一群胞质浓密的细胞。第五期的子房和柱头都明显伸长,且柱头突出于花药之上(图一-B5),推测此时花药已经预备开裂授粉,胚珠基部特化的细胞即为油腺细胞群,有浓密物质分泌,由组织化学染色可证实为油滴(图一-C5)。第六期则柱头明显高于花药,有褐化的现象应为已授粉状态(图一-B6),胚珠中心有明显加大情形(图一-C6)。第七期时花朵已展开,成熟花粉为黄色(图一-B7),胚珠基部胎座处有大范围油滴分布,胚胎发育也已经开始(图一-C7)。
    
    由不同发育阶段子房的切片观察推测,胚珠原首先由胎座边缘陆续突起,其内产生造孢细胞,在第一期时,可观察到胚珠原自胎座边缘突起成圆球形(图二A),造孢细胞四面八方向外分裂加厚。到第二、第三期时,已形成明显胚珠构造,此时珠被为4~5层仍在分裂的细胞(图二B),最内层行平周分裂(periclinal division)持续加厚,外层则行垂周分裂(anticlinal division),未来发育为种皮,中央为大孢子母细胞。第四期时大孢子母细胞于胚珠中央呈长椭圆形,开始分裂形成大孢子(图二C),珠被也有伸长情形,在第四期之胚珠基部有一群细胞质浓厚的多边型细胞(图二D),未来分化为油腺细胞。第五期时,大孢子发育已完成,在胎座下方可观察到细胞产生大量色素体(plastids) (图二E),以safranin和fast green双重染色可以看出细胞物质的差异。胚珠的基部有一群细胞质浓厚的细胞,由组织化学染色判断为油腺细胞,本区延伸到胎座。第六期时,大孢子已进行细胞分裂产生卵细胞、伴细胞、极核与反足细胞形成胚囊构造,此时花朵随时可授粉授精。
    
    三、组织化学检定
    
    
    (一)脂质染色-朝天椒与不辣甜椒细胞脂质分布的比较
    
    由朝天椒子房组织化学之检定观察脂质(lipid)的分布,可知朝天椒在胚珠尾端到胎座组织上有颜色较深的油胞染色(图三A第五期,箭头所指处),反观在甜椒胎座上颜色较不明显(图三B,第五期)。过去认为辣椒种子上并无油腺组织分部,Narasimha Prasad等(17)以辣素合成基因的组织免疫染色分析,认为辣素合成基因分布在胎座处表层组织之上,但是从本研究观察,朝天椒油腺细胞由胚珠内部距表皮约3~4层细胞即开始分化产生(图二D),因此Narasimha Prasad等所观察到胎座表面的绿色极可能是表皮细胞角质的萤光反应而已。Broderick与Cooke也利用切片和萤光观察,认为辣素在细胞中合成之后,透过apoplast途径运输到细胞之外贮存于细胞壁的皱折状结构中(21),此结果和本研究并无冲突之处。但本研究从胚胎发育初期即观察到此油腺细胞的分化与油脂的合成,提供了更明确的证据,本属朝天椒大孢子发育与子房组织化学特征的探讨63其他辣椒品种是否有同样的油腺细胞分布方式值得进一步探讨,未来更可以从组织切片上观察辣油生成与特化的油腺细胞是否有关连性。
    
    (二)多糖类(polysaccharides)与蛋白质之染色
    
    检测各时期子房组织的横切面,第一期花蕾近子房壁内侧表皮的薄壁细胞呈现较亮的粉红色区域为检测的多糖体(图四A,箭号所指处)。此内侧表皮层细胞在花芽发育初期便会迅速膨大,细胞核大而明显,这一层细胞在第五期时变成为且规则排列的大细胞(图二E,箭号所指处)。除此之外,表皮下3~5层细胞也富含多糖体。由第二期花蕾组织切片的蛋白质染色中也发现,在子房壁表皮下2层细胞、维管束和胚珠有较浓稠的蛋白质分布(图四B)。一般推测,细胞中较高量的蛋白质代表有旺盛的代谢活动,子房壁和胚珠因为有旺盛的细胞分裂活性,富含蛋白质并不令人意外,但是维管束部位也呈现浓稠蛋白质反应,是否意味着除了糖类、胺基酸等基础细胞建构物质被输入到花蕾之外,也包括蛋白质的输送,但在本研究并无法确认,需要多方比较不同区域的维管束,进行组织化学检测才能进一步确定蛋白质的反应位在韧皮部。
    
    (三)结晶沙的观察
    
    在花蕾的各个发育时期,结晶沙的量有随着胚珠发育逐渐增加的趋势,且大多集中在胎座和子房壁两大位置,在暗视野显微镜观察第一期的花蕾,鲜有结晶沙的出现(图五A),但第二期已可观察到结晶沙在胎座与子房壁上堆积(图五B)。到第四期结晶沙已经广泛分布在子房壁的维管束组织中,到第六期时结晶沙几乎可见于所有的维管束组织中。植物结晶被认为具有调节细胞水份的功能,植物结晶所分布的位置和数量不同对调节水分的效果也不同,也影响到植物的生长发育。观察朝天椒子房发育的各个时期,发现结晶沙会随着子房发育而逐渐累积,推测应是随着植物蒸散流而被带到胎座与子房壁并堆积在维管束组织附近。
    
    结 论
    
    本研究以朝天椒不同发育时期之花蕾为材料,将之分为七期进而切片观察大孢子发育过程,可知孢原细胞渐次发生于胎座上并持续生长发育,为连续性过程,人为分期乃为了能掌握大孢子发育的主要特征。在番椒育种实务上,各界所关切的主题包括细胞质雄不稔性基因(cytoplasmic male sterility, CMS)的发掘与运用,以及耐热甜椒品系的育成。目前已知番椒CMS基因为母系控制之粒线体基因变异,在花蕾发育阶段会造成雄不稔性(18),而甜椒在高温下无法着果亦肇因于花蕾期雄蕊及雌蕊发育阶段对高温敏感,因此有必要对照探讨耐热品种如朝天椒花蕾发育各阶段大、小孢子分化发育的情形。
    
    辣椒的辣素为人们所消费食用的主要对象,了解辣油或辣素在辣椒果实中的累积与分布,亦有助于对辣番椒或不辣番椒的育种。本研究首次以切片配合组织化学染色方式,得知辣椒油腺细胞在花蕾发育第四期即开始分化并累积油脂,而此细胞起源于胚珠延伸到胎座,这个结果与前人研究所认为辣素合成基因分布在胎座表面有所不同(17),未来或可进一步探讨此组织与油脂量多寡的关系。此外,在胚珠与胎座表皮层下2~5层细胞,于第五期细胞中的色素体大量发生,这些色素体即为叶绿体之前身,在根部与其他贮藏组织,色素体负责淀粉的代谢与贮存,在油性种子如大豆与油菜,色素体则负责脂肪酸与三酸甘油酯的合成,在此处是否也同时扮演与辣素、油脂合成相关的角色仍有待更深入探讨。
    
    本研究限于人力与时间,无法对各阶段花蕾切片进行全面的分析研究,小孢子分化发育的切片虽已完成,仍需时间作进一步的检视。尽管仍有未尽完善之处,本研究已经建立各阶段的大孢子的发育特征,未来不论是针对CMS基因或耐热性品系的研究探讨,皆可以运用本研究成果以切片对照检视大、小孢子发育阶段所受的影响。本研究也验证子房中胚珠发育阶段,油腺细胞在胚珠的分布与发育的进程,可作为未来辣椒辣油与辣素育种研究之参考。


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